贝那普利对高血压患者内皮祖细胞凋亡及氧化应激的影响

李永东 葛智平 温慧华 刘丹 阿拉坦高勒

.基础研究.

贝那普利对高血压患者内皮祖细胞凋亡及氧化应激的影响

李永东 葛智平 温慧华 刘丹 阿拉坦高勒

目的 探讨贝那普利对高血压患者内皮祖细胞（EPC）凋亡和氧化应激的影响。方法入选符合《中国高血压防治指南》诊断标准的1级高血压患者15例，同时选取年龄、性别相匹配的健康体检者15名为对照组。所有受试者抽取外周血，常规密度梯度离心法分离单个核细胞，将经鉴定的正在分化的EPC培养5 d后用于实验。将分离、培养获得的每一例高血压患者EPC培养5 d后将细胞平行分为5份，每份细胞根据不同的刺激处理条件分为高血压组、不同浓度贝那普利（1、10和100 μmol/L）干预组、贝那普利（10 μmol/L）+基质细胞衍生因子/受体趋化因子4（SDF-1/CXCR4）拮抗剂AMD3100干预组。上述干预24 h后进行EPC凋亡检测：用Annexin-V/PI法；氧化应激检测：黄嘌呤氧化法测定上清液中超氧化物歧化酶活力，硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量。结果 （1）与对照组比较，高血压组外周血EPC凋亡率明显增加（t早=6.6334，t晚=3.812；均为P＜0.01），氧化应激反应明显增高（tSOD=8.258，tMDA=6.6806；均为P＜0.01）；（2）随着贝那普利干预浓度的增加（1、10和100 μmol/L），EPC凋亡率也随之降低（F早=17.39，F晚=51.65；均为P＜0.05），氧化应激反应也随之降低，呈浓度依赖性（FSOD=14.56，FMDA=7.859；均为P＜0.05）。与10 μmol/L贝那普利干预组比较，10 μmol/L贝那普利+AMD 3100干预组的EPC凋亡率增加（t早=3.551，t晚=5.333；均为P早、晚＜0.05），氧化应激反应增高（tSOD=1.931，tMDA=0.6407；均为P＜0.05）。结论 贝那普利能显著改善高血压患者体外EPC凋亡及氧化应激反应，并可能通过SDF-1/CXCR4轴发挥作用。

高血压； 内皮祖细胞； 凋亡； 氧化应激； 拮抗剂AMD 3100

原发性高血压是最常见的心血管疾病之一，并可造成心脑肾及周围血管内皮损害，导致动脉粥样硬化。内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）是一群能增殖分化为成熟血管内皮细胞，参与出生后血管新生、血管形成及内皮损伤修复的前体细胞。EPC可维持内皮的完整和抑制内皮的激活，这种生物学作用在高血压的发生、发展中起关键作用。高血压的发病机制中肾素-血管紧张素系统起了重要作用，血管紧张素转化酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）通过抑制血管紧张素转化酶，削弱血管紧张素Ⅱ介导的各种病理作用，降低血压，改善血管、心脏重构，改善血管内皮细胞功能。已有研究表明，高血压血管损伤与EPC的凋亡增加和氧化应激反应增强有关［1-2］，而ACEI对高血压患者外周循环中EPC凋亡及氧化应有何影响，ACEI对高血压患者的治疗作用是否与EPC凋亡和氧化应激的改善有关目前国内外尚无相关研究。已知基质细胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）及其受体趋化因子4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4）之间的受体配体生物轴在EPC动员、迁移及归巢过程中起重要作用［3］。本实验拟探讨贝那普利能否改善高血压患者EPC凋亡和氧化应激反应，同时探讨SDF-1/ CXCR4轴在其中的可能作用。

1　材料和方法

1.1研究对象

2011年10月在内蒙古医科大学第三附属医院心内科入选符合《中国高血压防治指南》（2012版）诊断标准的1级高血压患者15例，年龄38～63岁，平均（47±12）岁，其中男性9例，女性6例。排除标准：既往服用过降压药物的患者；合并血脂、血糖代谢异常的患者；抽烟、酗酒者；合并感染性疾病如严重的上呼吸道感染、肺部、肝胆道感染等；高热，应用炎症抑制药物如非固醇类消炎镇痛药、类固醇和鸦片类药物者。同时选取年龄、性别相匹配的健康体检者15名作为对照组，年龄36～61岁，平均（46±11）岁，其中男性10例，女性5例。

1.2主要试剂和仪器

EGM-2-MV培养基为Lonza公司产品，DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（acLDL-DiI）和FITC-lectin为BTI公司产品，AMD3100为Roche公司产品，SDF-1试剂盒、CD34、CD133、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）试剂盒、丙二醛（malonaldehyde，MDA）试剂盒购自北京博奥森公司。细胞培养箱、多功能酶标仪为美国Thermo Fisher Scientific公司产品，流式细胞仪为BD公司产品，荧光倒置显微镜为尼康公司产品。

1.3人EPC的分离、培养和鉴定

所有研究对象于入选后第2天空腹采集新鲜外周抗凝血20 ml，常规密度梯度离心法分离单个核细胞。将单个核细胞以1×105个细胞/孔的密度接种在人纤维连接蛋白包被的6孔培养板上。加入EGM-2-MV培养基（hEGF，Hydrocortisone，VEGF，FGF-B，R3-IGF-1），于5%CO2培养箱中恒温培养。培养4 d后，用PBS洗掉非贴壁细胞。为维持细胞原生存环境，EGM-2-MV培养基中加入20%的患者来源血清细胞，继续培养至5 d后进行各种检测分析。贴壁细胞用acLDL-DiI和FITC-lectin行荧光化学染色，激光共聚焦显微镜下观察，染色双阳性细胞被认为是正在分化的EPC，每孔随机选择15个视野（×200）行EPC计数。取其平均值换算为每平方毫米的细胞个数记录。将培养5 d的EPC消化，制成细胞悬液，按操作说明书加入CD34及CD133单克隆抗体，流式细胞仪分析细胞CD34、CD133的表达。

1.4实验分组和方法

将上述分离得到的每例人群EPC培养5 d后用于实验研究；15例正常组人群EPC作为实验对照组，而15例高血压患者人群分离得到的EPC培养5 d后，将每例患者来源的内皮祖细胞平行分为5份，根据不同的处理条件设置为5组：高血压组、不同浓度贝那普利（1、10和100 μmol/L）干预高血压组和贝那普利（10 μmol/L）+SDF-1/CXCR4拮抗剂AMD3100干预组；每组都为15例。其中贝那普利原粉以不同浓度（1、10和100 μmol/L）与高血压组EPC共培养24 h（在含20%患者来源血清的培养基中同时加入贝那普利，于37 C、5%CO2饱和湿度条件的细胞培养箱中培养）。随后检测所有实验组外周血EPC凋亡率和氧化应激水平。

1.5检测项目和方法

1.5.1贝那普利干预对EPC凋亡的影响 用含1%患者来源血清细胞的EGM-2-MV培养基继续培养12 h后开始实验。需用AMD3100预处理的细胞组，经20 μmol/L AMD3100预处理1 h，用含20%患者血清的培养液培养24 h，按Annexin-V-FLUOS staining kit的操作说明进行FITC-Annexin-V/PI的荧光染色，在荧光显微镜下（×400）观察并应用流式细胞仪计数凋亡细胞占所有细胞的比例，每组设3个复孔，实验重复3次。FITC+PI-的细胞为早期凋亡细胞，FITC+PI+的细胞为晚期凋亡细胞。

1.5.2贝那普利干预EPC氧化应激的检测 1%患者来源血清细胞的EGM-2-MV培养基继续培养12 h后开始实验。需AMD3100预处理的细胞组，经20 μmol/L AMD 3100预处理1 h，用含20%患者血清的培养液培养24 h，黄嘌呤氧化法测定上清液中SOD活力，硫代巴比妥酸法测定MDA含量。按试剂盒说明书进行操作，分光光度仪测定各组的吸光度OD值，计算各组的SOD活性和MDA含量。

1.6统计学方法

采用SPSS 11.0统计软件对数据进行分析，计量资料用表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1EPC的鉴定

人EPC分离培养第5天时，倒置显微镜下可见细胞呈短梭形，为单层细胞。用acLDL-DiI及FITC标记荆豆凝集素（FITC-UEA-I）对细胞染色后，用荧光显微镜观察，发红色荧光的为acLDL-DiI阳性细胞，发绿色荧光的是UEA-I阳性细胞，染色双阳性的细胞为正在分化的EPC。流式细胞仪分析CD34和CD133的阳性率分别为72.55%±5.17%和71.31±4.39%。见图1。

图1　人外周血EPC经acLDL-DiI和FITC-UEA-Ⅰ双荧光染色鉴定结果

2.2贝那普利对EPC凋亡的影响及SDF-1 CXCR 4拮抗剂AMD3100在其中的作用

与对照组比较，高血压组样本EPC凋亡率明显增高（t早=6.6334，t晚=3.812；均为P＜0.01）。用1、10和100 μmol/L的贝那普利干预体外培养的高血压患者EPC 24 h，检测其凋亡率显示，随着贝那普利浓度逐渐增加，EPC早期、晚期凋亡率均逐渐降低，并呈浓度依赖性（F早=17.39，F晚=51.65；均为P＜0.05）。与10 μmol/L贝那普利干预组比较，10 μmol/L贝那普利+AMD 3100组的EPC凋亡率升高（t早=3.551，t晚=5.333；均为P＜0.05）。见表1。

表1　不同浓度贝那普利对EPC凋亡率的影响（，%）

表1　不同浓度贝那普利对EPC凋亡率的影响（，%）

注：与对照组比较，aP＜0.01；与高血压组比较，bP＜0.05；与10 μmol/L干预组比较，cP＜0.05

组别例数早期凋亡率晚期凋亡率对照组153.2±2.14.7±2.9高血压组159.2±3.1a8.6±3.2a贝那普利干预组1 μmol/L组157.4±2.7b6.5±2.0b10 μmol/L组155.3±2.4b4.6±3.1b100 μmol/L组153.6±1.9b2.6±1.6b10 μmol/L+AMD 3100组158.9±2.9c7.9±3.0c

2.3贝那普利对EPC氧化应激的影响及SDF-1 CXCR4拮抗剂AMD3100在其中的作用

与对照组比较，高血压组样本SOD活性明显降低，MDA含量明显升高（tSOD=8.258，tMDA=6.6806；P＜0.01），用1、10和100 μmol/L贝那普利干预体外培养的高血压患者EPC 24 h，检测其氧化应激的变化显示，随着贝那普利浓度逐渐增加，EPC的SOD活性逐渐升高，MDA含量逐渐减低，并呈浓度依赖性（FSOD=14.56，FMDA=7.859；均为P＜0.05）。与10 μmol/L贝那普利干预组比较，10 μmol/L贝那普利+AMD3100组SOD活性降低，MDA含量升高（tSOD=1.931，tMDA=0.6407；均为P＜0.05）。见表2。

表2　不同浓度贝那普利对EPC的SOD、MDA影响（）

表2　不同浓度贝那普利对EPC的SOD、MDA影响（）

注：与对照组比较，aP＜0.01；与高血压组比较，bP＜0.05；与10 μmol/L干预组比较，cP＜0.05

组别例数SOD（U/ml）MDA（mmol/ml）对照组1578.49±8.999.41±1.61高血压组1540.64±9.84a16.17±2.41a贝那普利干预组1 μmol/L组1552.81±10.29b14.81±2.18b10 μmol/L组1564.74±10.84b12.71±1.93b100 μmol/L组1576.29±11.12b9.84±1.73b10 μmol/L+AMD 3100组1541.59±10.12c15.89±2.07c

3　讨论

EPC是一类具有特异性归巢于损伤区域并能分化增殖为成熟内皮细胞的干（祖）细胞。存在于外周血、骨髓和脐静脉血中，是成熟内皮细胞的前体细胞，其生物学功能主要是促进血管新生和参与血管损伤后的内皮修复［4］。

Oliveras等［5］发现，高血压患者外周血EPC数量明显减少，而且比EPC数量减少发生更早的是EPC功能的紊乱，功能受损与凋亡及氧化应激有密切关系。

MDA是脂质过氧化损伤的主要代谢产物，具有细胞毒性，能较好地反映细胞氧化损伤的程度；而SOD是清除体内自由基系统的主要酶，SOD活力的高低间接反映机体清除氧自由基的能力；SOD活性和MDA含量可反映机体清除氧自由基的能力及细胞受自由基损伤的严重程度，两者水平的变化在一定程度上可以反映过氧化损伤的程度［6］。

本研究显示，与对照组比较，高血压组外周血EPC早期、晚期凋亡率明显增加，与以往研究相一致；而与对照组比较，高血压组SOD明显降低，MDA明显升高，表明高血压患者的EPC氧化应激反应增强。氧化应激通过减弱EPC抗氧化酶的表达，增加氧化酶的表达而促进EPC的凋亡进而影响其数量与功能［7］。

高血压发生时，血管紧张素Ⅱ通过诱发氧化应激反应抑制EPC分化，抑制端粒酶活性，加速EPC老化，且使EPC分化成熟为完整内皮细胞的能力减弱，会削弱其血管修复的能力［8］；Imanishi等［9］指出，EPC的衰老是加速基础血压升高和恶化的独立危险因素。

我们应用1、10和100 μmol/L贝那普利干预体外培养的高血压患者EPC 24 h，检测凋亡和氧化应激的变化显示，随着贝那普利浓度逐渐增加，EPC早期、晚期凋亡率降低，同时SOD活性逐渐升高，MDA含量逐渐减低，即改善了氧化反应水平，并呈浓度依赖性（均为P＜0.05）。提示贝那普利可减少高血压患者EPC的凋亡，改善EPC的氧化应激反应。考虑可能机制：（1）ACEI贝那普利通过促进EPC的动员，引起EPC数量的增多；（2）提高EPC的抗氧化酶活性及抑制脂质过氧化物生成；（3）局部的肾素血管紧张素系统也可调节EPC功能［10-11］。

SDF-1又名前B细胞刺激因子，属于CXC族趋化因子成员，SDF-1主要在骨髓基质细胞及骨髓内皮细胞表达。研究表明，在损伤血管的平滑肌也有SDF-1强表达。SDF-1唯一的受体CXCR4，是一个有7个跨膜结构域的G蛋白偶联受体，在EPC表面高度表达。SDF-1/CXCR4轴参与EPC的生物学性能，如动员、迁移和归巢等［3］。

本研究中，应用SDF-1/CXCR4轴特异性拮抗剂AMD 3100观察了其对贝那普利干预EPC的影响，发现与10 μmol/L贝那普利干预组比较，在加入AMD 3100共培养后EPC凋亡增加和氧化应激水平明显升高，提示贝那普利对高血压患者EPC凋亡和氧化应激的影响可能通过SDF-1/CXCR4轴起作用。

综上，EPC凋亡增加和氧化应激导致内皮修复和血管再生能力受损，加速高血压的发生发展。贝那普利可改善EPC的凋亡和氧化应激反应，改善血管内皮功能。对于EPC在高血压病理过程中作用的研究才刚刚开始，高血压与EPC关系的研究还需要进一步深入，随着两者之间的关系逐渐明朗，将可能为高血压的防治提供一条新的途径。

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Effects of Benner Pury on endothelial progenitor cells apoptosis and oxidative stress in patients with hypertension

Li Yongdong1，2，Ge Zhiping1，Wen Huihua1，Liu Dan1，Alatan Gaole2.1 Department of Cardiology，the Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Baotou 014010，China；2 College of Life Science Hohhot，Inner Mongolia University

Li Yongdong，Email：lyd20070501@163.com

Objective To investigate the effection of Benner Pury on endothelial progenitor cells apoptosis and oxidative stress in vitro hypertension.Methods The patients who were diagnosed as hypertension grade 1，according to the standard″Guidelines for Prevention and Treatment of Hypertension″. The control group were healthy subjects matched with study group in age and gender.Mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation，and fluorescence chemical staining in acLDL-DiI，FITC-lectin，observed under confocal laser scanning microscope，staining positive cells were considered as the differentiation of endothelial progenitor cell（EPC）.EPC cultivated for 5 days were used for study.The cells isolated from each hypertensive were divided into five copies in parallel，and according to the different stimulation，the cells were divided into five groups：hypertension group，different concentrations of Benner Pury（1 μmol/L，10 μmol/L，100 μmol/L）intervention in hypertension group，and Benner Pury（10μmol/L）+stromal cell derived factor-1（SDF-1）/its receptor chemokine 4（CXCR4）antagonist AMD 3100 pretreatment group.EPC cultivated for 24 h under the different stimulation were used for study EPC apoptosis detection：Annexin-V/PI method；oxidative stress detection：the activity of superoxide dismutase（SOD），xanthine-oxidation method，the content of Malonaldehyde（MDA）malondialdehyde thiobarbituric acid method.Results （1）Compared with the control group，peripheral blood EPS apoptosis rate was obviously increased in hypertension group，oxidative stress was significantly increased too（tearly=6.6334，tlate=3.812；both P＜0.01）.（2）Detection of the apoptosis and oxidative stress level display，different concentrations of Benner Pury 1 μmol/L，10 μmol/L，100 μmol/L intervention in vitro hypertensive patients EPC for 24 h，with the concentrations of Benner Pury gradually increased，the apoptosis rate of EPC was reduced（Fearly=17.39，Flate=51.65；both P＜0.05），oxidative stress response also come down in a concentration dependent manner（FSOD=14.56，FMDA=7.859；both P＜0.05）.Compared with 10 μmol/L pretreatment group，10 μmol/L+group AMD 3100，EPC apoptosis rate increased（tearly=3.551，tlate= 5.333，both P＜0.05），oxidative stress response raised up（tSOD=1.931，tMDA=0.6407，both P＜0.05）. Conclusions BennerPury significantly improved the apoptosis of EPC and oxidative stress response in vitro hypertension，and the function may be through the SDF-1/CXCR4 axis.

Hypertension； Endothelial progenitor cells； Apoptosis； Oxidative stress；Antagonist AMD 3100

2014-10-10）

（本文编辑：谭潇）

10.3969/j.issn.1007-5410.2015.01.012

内蒙古自治区自然科学基金项目（2011MS1150）

014010包头，内蒙古医科大学第三附属医院心内科（李永东、葛智平、温慧华、刘丹）；内蒙古大学生命科学学院（李永东、阿拉坦高勒）

李永东，电子信箱：lyd20070501@163.com

This workwassupportedbyagrantfrom theNaturalScienceFundProjectofInnerMongolia（No.2011MS1150）