简析地中海贫血高风险儿童β—地中海贫血基因

温乃健

【摘要】目的：探讨地中海贫血高风险儿童β-地中海贫血基因的检测后的检出率，和该基因的构成情况，并提出有效的防治策略以降低β-地中海贫血发生概率。方法：150例地中海贫血高风险儿童采取双重PCR技术和反向斑点杂交技术（PDB）进行β-地中海贫血基因检测、分析。结果：在150例受检儿童中，检测出β-地中海贫血儿童49例，占总数的30%左右，涉及基因突变类型8种。结论：不同基因类型具有不同的临床表现，β-地贫纯合子和双重杂合子具有严重的临床表现，需要制定有效措施来降低这两种类型儿童的出生率，提高人口素质。

【关键词】地中海贫血；β-地中海贫血基因；儿童

【中图分类号】R725.5 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）03-0556-02

1、引言

地中海贫血是一组遗传性溶血性贫血疾病，具有高发病率，由于存在遗传的基因缺陷，使得血红蛋白中一种或多种珠蛋白链合成减少或不足，其中 -地中海贫血和β-地中海贫血最常见，占有的比例最高。地中海贫血广泛分布于世界各地，最严重地区是东南亚，在我国多数集中在广东、广西、四川等地，长江以南各省区只有少数几例，再往北则更加少见，具有明显的种族和地域差异性。β-地中海贫血较常出现在儿童身上，发病率较高，严重影响儿童的身体健康发育和心理成长，给家庭和社会带来了沉重负担。必须采取预防控制措施，有效降低我国高发地区的发病情况。

2、资料与方法

2.1 一般资料

150例地中海贫血高风险儿童均为我院2013年5月至2014年12月期间检测病人，其中男98例，女52例，年龄普遍在10d～12岁之间。所有病患采取空腹抽外周血2ml，采取EDTA-K2抗凝，血样在4oC下保存。

试剂：人全血基因组DNA提取试剂盒、β-地中海贫血诊断试剂盒

仪器：TGRADIENT温度梯度PCR仪器、高压双稳电泳仪、琼脂糖水平电泳槽、凝胶图像处理系统等。

2.2 方法

（1）诊断

对150例患者提取人全血基因组DNA，一切按照该试剂的操作说明操作。再进行单管二重PCR反应测试，反应结果显示94oC总变性4min；94oC 60s，56oC 30s，74oC 60s，一共经历34个循环，循环结束后74oC达到总延伸4min。对PCR产物进行分析：选用适量6 溴酚蓝上样缓冲液和扩增产物3 进行混合均匀，在2.0%的琼脂糖凝胶上进行上样，后在70V电泳下操作40min，用数码凝胶图像处理系统进行样品观察，如样品中同时存在600bp 和200bp 各1条，则进行后续实验。

（2）杂交

选用15ml的塑料离心管进行杂交实验，并对离心管标注受试者编号，在离心管内放入相应的患者杂交膜条，添加10ml杂交液，再添加相应的PCR产物，后封闭离心管。将塑料离心管在沸水中进行10min的加热处理，再在42oC 的杂交箱内进行5h的杂交。

（3）洗膜

杂交完成后将离心管内的膜条取出，放入42oC的洗膜液中，进行30min的輕摇洗涤。

（4）显色

选取杂交液按照1：4000比例进行适量的POD溶液配制，将膜条放入溶液中轻摇浸泡30min，再用适量杂交液进行膜条的5min轻摇洗涤2次，后用柠檬酸钠液再次对膜条进行2min的轻摇洗涤2次，以上过程全部在室温完成。将取出的膜条浸入到最新配制的显色液中进行15min的避光显色操作，完成后的膜条迅速在纯水中漂洗，后判定实验结果。这种检测方法可同时检测中国人基因中的8种常见的和9种少见的β-地中海贫血基因突变位点。

（5）实验结果

对膜条上相应探针位置，判断是否存在蓝色斑点。一般结果有几下几种：1）只有突变型探针位置存在蓝色斑点，则为纯合突变型，该基因点位同时在两个等位基因处发生了基因突变；2）突变型探针位置不存在蓝色斑点而野生型探针位置存在蓝色斑点，则为杂合突变型，该基因点位只有一个等位基因处发生了基因突变；3）只有野生型探针位置存在蓝色斑点，则为野生型，没有发生基因突变。

3、结果

通过PCR-PDB方法对150例地中海贫血患者进行诊断，结果为β-地中海贫血基因型正常的儿童有101例，占70%左右，而患有β-地中海贫血的儿童有49例，占30%左右。存在的基因突变类型有8种：CD43（G T），CD26（G A），CD17（A T），CD41-42（-TCTT），-28（A G），CD71-72（+A），-29（A G），IVS-Ⅱ-654（C T）。

4、讨论

地中海贫血是一种发病率极高的高风险单基因遗传病，β-地中海贫血是最主要的一种地中海贫血类型，也是患病率较高的一种。β-地中海贫血的临床表现较为复杂，基本上有轻、中、重型三种，不同的基因突变形成的临床表现不同，β-地中海贫血纯合子和双重杂交合子的临床表现最为严重，重度贫血且发病期早，容易形成肝、脾肿大。产生这种现象的主要原因是存在CD17和 CD43这种可以产生无意义的密码子突变现象，而其他的CD27-28、CD41-42、28/CD71-72存在移码突变，使得阅读框架发生变化，影响β珠蛋白肽链的正常合成，使其提前终止合成，而654则影响RNA加工，使β珠蛋白肽链合成存在障碍等。其中IVS-Ⅱ-654（C T）突变型是最常见的，之后是CD41-42（-TCTT），CD17（A T），-28（A G），这四种突变类型占全部类型中的90%左右

本文的研究对象是地中海贫血高风险地区的儿童，其β-地中海贫血检出率比其他地区要高，但不能说明实际发病率一定也这么高。广东、广西、四川等地是我国地中海贫血高检出地方，也是较高发病率地点，人口密度基数在我国南方属于人口密集处，必须制定可行的防止措施降低β-地中海贫血患儿的出生率，如根据四种突变类型最高的基因型提高产前诊断、开展遗传咨询等，提高我国人口质量。

参考文献

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[3] 李贵才；谢鹤；王朋朋.潮州地区地中海贫血患儿基因突变类型分析[J].中华全科医学.2012年06期.