比较四种工艺提取的莪术油对Hela细胞外LDH活性影响

张卫霞 罗俊 潘年松

【摘要】目的 探讨四种工艺从莪术中提取的挥发油对Hela细胞外LDH活性影响的差异性，并以此旁证遴选最优工艺。方法 分别采用石油醚浸提法、超临界CO2萃取法、压榨粗油经水蒸气蒸馏法精制、水蒸气蒸馏法提取莪术油，经标准品比对等纯度鉴定后，分别配制成浓度为10、20、40、80、160、320、640μg/ml的莪术油干预Hela细胞72h，按照LDH试剂盒说明检测细胞外LDH水平。结果 压榨法提取的莪术油在20·g/ml、其它三种方式提取莪术油20·g/ml作用于Hela细胞72h后的LDH值与阴性组比较呈现出显著差异性，且明显呈量效正相关。结论 四种工艺提取的莪术油均可量效正相关地激活LDH；压榨粗油经水蒸气蒸馏法精制莪术油对LDH的激活作用显示出量效敏感优势，提示压榨粗油经水蒸气蒸馏法精制可能为最佳工艺。

【关键词】：莪术油；LDH；活性；比较

【中图分类号】R722.12 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）03-0144-02

基金项目：贵州省社会发展项目（黔科合SY（2008）3027号）。

温莪术为姜科植物温郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根茎，具行气破血，消积止痛之功。用于治疗瘢瘕痞块，淤血经闭，食积胀痛，早期宫颈癌1。目前关于温莪术中挥发油的提取工艺有水蒸气蒸馏提取法、CO2超临界萃取提取法、鲜品榨汁提取法、石油醚回流提取法2-4，但较少有文献就挥发油的各种提取工艺的药效学进行比较，鉴于中药的不同制备工艺所得的药品抗肿瘤药效也存在不同2。因此，对在不同工艺中提取的同一药品进行药效比较从而筛选出最佳提取工艺是有必要的。

1.材料与方法

1.1 实验药物 温莪术药材购于四川双流县温郁金基地，经遵义医药高等专科学校中药学副教授张学愈鉴定为姜科植物温郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根茎。四种莪术油（分别由水蒸气蒸馏提取法、超临界CO2萃取提取法、鲜品榨汁经水蒸气蒸馏精制法、石油醚浸提法提取，由遵义医药高等专科学校制备，用Tween-80溶解，配成10mg/mL的贮存溶液，4℃避光保存。

1.2试剂 人宫颈癌Hela细胞株（中国典型培养物保藏中心，细胞编号：GDC009）；RPMI-1640培养基、MTT及胰酶（Sigma公司）；胎牛血清（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）。

1.3仪器 BIO-TEK ELX 800-UV全自动酶标仪（美国宝特），LC-2900型高效液相色谱仪（上海天普）。

1.4 方法

1.4.1细胞的培养 取人宫颈癌Hela细胞，培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置5%CO2、37℃培养箱中，每1-2天传代一次。

1.4.2 MTT试验 将对数生长期的Hela细胞消化并制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为3×104/ml，按每孔180·l接种于96孔板，培养24h后分为空白调零组（仅加培养基）、阴性对照组（无血清培养基）、阳性对照组（5-Fu 10·g/ml）、溶酶组（加入等体积的0.5% Tween-80溶液）挥发油组（四种方式提取挥发油，均设10、20、40、80、160、320、640·g/ml七个浓度梯度组），每组设10个平行孔，每孔加入20ul的药物，继续培养72h，于结束前4h小心吸去上清，加入无血清培养基200μl/孔，并加入20μl/孔浓度为5mg/ml的MTT，培养4h后吸弃培养基，每孔加入DMSO 150μl，混合器振荡10min，使其充分溶解，置于自動酶标仪上，以490nm波长测定各孔的吸光度OD值[4]。重复实验三次。

1.4.3 LDH活性检测 收集上述加无血清培养基之前的上清液，根据南京建成LDH试剂盒说明检测细胞外LDH水平。LDH活性（U/L）=（测定孔OD值-对照孔OD值）/（标准孔OD值-空白孔OD值）×标准浓度（0.2mmol/L）×样品测试前稀释倍数×1000。

1.4.5 统计处理 所有数据以X±s表示，组间比较采用t检验。P<0.05认为有差异，P<0.01认为有显著性差异。

2.结果与讨论

四种工艺提取莪术挥发油的LDH值较阴性对照组明显升高（P<0.05，P<0.01），其中鲜品榨汁经水蒸气蒸馏精制法挥发油在320ug/ml时LDH值最高（表1）。

表1 四种方式提取莪术油作用于Hela细胞72h后的LDH值（U/L） （X±s，n=10）

药物浓度（·g/ml） 莪（石） 莪（超） 莪（压） 莪（水） 阴性对照组0 — — — — 97.39±12.3610 145.46±9.84 101.65±8.43 187.86±11.78﹡ 125.13±12.83 20 164.66±7.51﹡ 136.85±13.36﹡ 243.13±12.36△ 150.67±15.82﹡ 40 234.12±21.32△ 162.32±18.44﹡ 296.65±19.14△ 257.25±30.77△ 80 298.15±22.77△ 207.82±15.99△ 338.39±23.89△ 277.72±23.01△ 160 398.31±17.28△ 280.58±41.92△ 437.47±25.71△ 315.97±50.00△ 320 428.13±25.09△ 319.83±18.85△ 463.10±16.76△ 370.31±22.73△ 640 395.92±40.38△ 331.71±40.38△ 422.35±27.25△ 386.51±36.54△ 与阴性对照组比较﹡P<0.05，△P<0.01

从实验结果总体趋势而言，压榨法提取的莪术油在20·g/ml、其它三种方式提取莪术油20·g/ml作用于Hela细胞72h后的LDH值与阴性组比较呈现出显著差异性，且明显呈量效正相关。

仅从压榨粗油经水蒸气蒸馏法精制莪术油对激活LDH 活性较优而论，从莪术中提取挥发油以先压榨获得粗油再水蒸气蒸馏浓缩提取精油工艺为佳。

参考文献

[1]国家药典委员会.中国药典，一部[S].北京：化学工业出版社，2005

[2]邹俊，涂铭旌，张学愈，等.不同提取工艺制备的温莪术挥发油对Hela细胞的增殖抑制作用[J].四川大学学报（医学版），2008，39（4）：671～672.

[3]张学愈，盛勇，邹俊，涂铭旌，潘年松，等.石油醚提取过50目和过325目筛目筛温莪术挥发油收率比较[J].时珍国医国药，2009，20（2）：292～293.

[4]肖艳，李俊东，等.MTT法体外药敏实验预测宫颈癌细胞药物敏感性的初步探讨[J].癌症，2007，26（4）：386-389.