前列腺癌相关风险位点rs1800477在LNCaP细胞系功能研究

辛先祥 胡艳玲

【摘要】目的：验证前期研究发现的前列腺癌相关风险位点rs1800477的功能。方法：选用前列腺癌LNCaP细胞系作为实验细胞，针对位点rs1800477构建慢病毒载体，并转染LNCap细胞，通过对LNCap进行划痕实验，比较各组的迁移率，实验分为4组；空白对照组（CON）： 正常LNCap细胞未感染任何病毒的细胞组；阴性对照组（NC）：正常LNCap细胞加阴性对照病毒感染的细胞组；野生型组（OE-wt）：正常LNCap细胞加目的基因BCL2野生型病毒感染的细胞组；突变型组（OE-mu）：正常LNCap细胞加目的基因BEL2突变型病毒感染的细胞组。分别于6h和24h测量各组的细胞迁移距离并计算迁移率。结果：6h和24h时，野生型组和突变型组均出现差异，野生型组细胞迁移率分别为（0.24±0.02）%和（0.40±0.03）%，突变组细胞迁移率分别为（0.23±0.01）%和（0.41±0.03）%，与空白对照组比较差异均有统计学意义（p均<0.05），但野生型组与突变型组比较差异均无统计学意义（p=0.454、0.618）。结论：前期研究发现的风险位点rs1800477对前列腺癌细胞系LNCaP的迁移能力无显著影响。

【关键词】前列腺癌；LNCap；风险位点；功能研究

【中图分类号】R737.25 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）03-0092-01

*基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.81272853和No. 81060213）

广西医科大学研究生创新课题（No. YCSZ2014106）

前列腺癌在男性致死性疾病中排名第六，近20年前列腺癌全球内的发病率逐年增加[1]。2008年的一项对年龄小于75岁的男性前列腺癌调查研究报道显示，有903500名男性被确诊为前列腺癌，其中258400人因前列腺癌导致死亡。前列腺癌不仅能在因原位器官引起症状，转移到其他器官引起的病症能带来更大的痛苦，这不仅增加了家庭的负担还给全社会造成了很大影响。越来越多的科学家试图从基因水平揭露前列腺癌的发病机制。遗传多态性是最常见的遗传变异，但遗传因素导致的癌症的确切机制还没有研究清楚。单核苷酸多态性（SNPs）的研究表明位点突变通过与环境因素的相互作用引起相关癌症的发生。位点的突变能够引起相关氨基酸结构和功能的改变，从而导致癌症的发生。在我们的前期研究[2]中发现位于BCL2基因的位点rs1800477通过关联分析发现与前列腺癌存在相关，在本研究中用细胞划痕实验对上述结果进行验证。

1材料与方法

1.1主要试剂与材料

LNCaP细胞系由天津南开大学赠送。Taq polymerase （SinoBio 批号E001-02B）， dNTP（Takara， 批号D4030A），胎牛血清（Gibco），REMI Medium 1640（Gibco），限制性内切酶（NEB），BamHI/Agel酶切（上海吉凯基因化学技术有限公司），GV166载体（上海吉凯基因化学技术有限公司），positive clone测序（美季生物技术，型号ABI3730），PCR仪（Applied Biosystems， 美国），细胞培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），细菌摇床（华利达实验设备公司，型号HI-92111K），37℃，Gilson移液器（吉尔森公司），5%CO2恒温培养箱（CEDCO）。

1.2 过表达慢病毒载体的构建

1.2.1载体酶切： 基因信息：基因名称为BCL2（NM-000633），物种为Human。载体信息：①载体名称：GV166。②元件顺序：Ubi-MCS-3FLAG-IRES-puro。③克隆位点：BamHI / AgeI。酶切反应体系：37℃，2h。试剂体积：ddH2O 42μL；10×buffer 5μL；纯化的DNA质粒（1g/L） 2μL；Agel（5U/μL）。

1.2.2 目的基因片段的獲取：引物交配碱基、酶切位点，并含有目的基因5端部分序列用于PCR钓取目的基因，具体序列为：BCL2-F：aggtcgactctagaggatcccgccaccatggcgcacgggagaac；

BCL2-R：agtccatggtggcgaccggctgtggcccgataggcac。

PCR反应体系：ddH2O 12.4μL；5×Taq buffer 4μL；dNTPs（2.5mmol/L） 1.6μL；Primer（+）（10μmol/L） 0.4μL；Primer（-）（10μmol/L） 0.4μL；Template（10g/L） 1μL；Taq polymerase 0.2μL。PCR反应条件：94℃，5min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，∞ ；30cycle。

1.3 慢病毒的感染

⑴处于对数生长期的PC3细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液。⑵将细胞悬液（细胞数约为5×104）接种于6孔板 中，37℃ 5%CO2 培养箱培养待细胞融合度达到约30%。⑶根据公式：MOI 值=病毒量×滴度/感染细胞数，各组MOI值均为20，可计算出各组需要加入的病毒量（NC组滴度为（2E+9）TU/mL，病毒加入量2μL；OE-mu组与OE-wt组滴度均为（2E+8）TU/mL，病毒加入量20μL）。感染条件为1640+10%FBS+5 g/L polybrene。⑷12h后观察细胞状态：如果有明显的细胞毒性作用[5]，立即更换培养基；如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24h后更换培养基。⑸感染3d后观察慢病毒上报告基因GFP 的表达情况。⑹感染9d后进行细胞划痕实验，整个过程记录细胞生长状态变化。

1.4细胞培养和处理

用含有10%胎牛血清的培养液进行常规培养，放置于37℃，5%CO2 的恒温培养箱。为保证细胞的正常生长，细胞液隔天进行更换。实验分为4组，（1） 空白对照组（CON）： 正常LNCap细胞未感染任何病毒的细胞组； （2） 阴性对照组（NC）：正常LNCap细胞加阴性对照病毒感染的细胞组； （3） 野生型组（OE-wt）：正常LNCap细胞加目的基因BCL2野生型病毒感染的细胞组； （4） 突变型组（OE-mu）：正常LNCap细胞加目的基因BEL2突变型病毒感染的细胞组。

1.5划痕实验

按照实验设计分为4组，往96孔板中加入约5X104个经慢病毒感染后的LNCap细胞。第2天上午换无血清培养基，使用划痕仪对准96孔板的下端中央部位，向上轻推形成划痕。使用无血清培养基轻轻漂洗2遍，加入无血清培养基，拍照0h。放入37℃5% CO2培养箱培养。培养8～24h后取出，荧光显微镜拍照（以96孔中心阴影区域为参照，划痕在图片的正中）。在0，6，24h进行图像采集和细胞迁移距离的测量，将采集的图像通过Image-Pro5.0软件，计算各个时间点细胞未覆盖的面积，并与0h时的无细胞区域面积比较以反映细胞的迁移率。每组实验重复3次。

1.6数据分析

资料存放于Excel数据库，每组均重复3次实验因此用计算平均迁移率。LSD-T检验被用来比较两组之间的差异。 若（P>0.05）认为具有统计学差异。 SPSS16.0被用来进行LSD-T检验和方差分析。迁移率计算公式：迁移率=（T0时面积-Tt时面积）/T0时面积×100%。

2 结果

2.1形态学观察

LNCaP细胞转染72小时后，在荧光显微镜（100×）下观察和图像采集，如图1所示：可见CON组的细胞数明显高于另外三组；NC组的细胞数略高于OE-wt和OE-mu组；OE-wt和OE-mu细胞数差别不大；四个组的细胞形态没有区别，均生长良好。以上结果可以表明rs1800477的突变对前列腺癌LNCaP细胞的迁移无明显作用。

2.2划痕实验

在0小时，6小时和24小时分别测量并记录了四组细胞均出现迁移变化（表1），并计算平均迁移率。迁移率比较（表2，3）显示，在6小时突变型和野生型迁移率变化均出现差异，P值分别为0.009，0.036；24小时仍有显著差异，P值分别为0.012，0.007。但野生型与突变型相比无显著差异，6小时和24小时的P值分别为0.453，0.617，表明位点rs1800477对前列腺癌LNCaP细胞系的转移并无显著影响。

表1. 四组细胞迁移距离信息表

时间 CON NC OE-WT OE-MU0 h 30.8 26.78 28.4 30.97 26.95 30.55 28.86 24.73 30.66 28.96 28.54 30.976 h 21.63 18.91 20.71

3 讨论

前列腺癌发病率的逐年增高和转移性已经引起全球的广泛关注。饮食习惯、种族、性行为方式、病毒感染等因素均能对前列腺癌的发病造成影响[3]。对前列腺癌的研究已经不再局限于宏观改善症状，现在的研究主要集中于从分子层面探索前列腺癌发病机制，进一步找到预防和治疗方法。LNCaP细胞系是从人类前列腺癌淋巴转移细胞中分离出来，保留了前列腺癌细胞的分化和增值特性[4]。

随着测序技术的发展，越来越多的前列腺癌相关的风险位点被发现，为我们的后续研究提供了丰富的资源，许多研究生人员进行了单核苷酸多态性与前列腺癌关系的研究，并验证了相关位点与前列腺癌的相关性。一项研究发现位于NKX3.1上位点rs2228013的突变能够增加前列腺癌的转移[5]。另一项病例对照研究发现了位于CYP19A1的风险位点rs4775936，前列腺癌患者中突变型的生存时间比野生型的明显缩短，这项发现已经在DU145和PC3细胞系中验证。作为BCL2基因家族的一员，BCL2基因能够通过诱导相关基因的表达来调控细胞的程序性凋亡。RTK/ERK信号通路已经被广泛的证明与前列腺癌相关的重要通路，作为信号通路中的关键基因BCL2能够通过调控通路中相关基因的泛素化和磷酸化而影响基因的表达，进一步导致前列腺癌的发生和转移。研究人员在DU145细胞系中发现BCL2表达程度的降低能够选择性降低ERK1/2，AKT信号通路的活性，并显著降低肿瘤的发生率。

我们的研究位點rs1800477位于18号染色体，该位点尚未报道与癌症相关。在一项对汉族人群的研究中发现rs1800477的突变能将原来编码的丙氨酸变为苏氨酸能导致男性少精。我们前期通过在中国前列腺癌协作组完成的全基因组扫描数据中进行rs1800477进行大样本的关联分析发下，该位点显著与前列腺癌的发生存在相关性。但本研究在LNCaP细胞系的功能验证说明rs1800477与前列腺癌无明显相关性。本实验只在LNCaP一种细胞系中进行验证，有一定的局限性，临床原始样本基因组扫描发现的风险位点，用于单一细胞系中验证，不能全面验证位点rs1800477与前列腺癌的关联性。后续实验欲在其他细胞系中进行功能验证。

参考文献

[1]Plata BA， Concepcion MT. Prostate cancer epidemiology[J]. Arch Esp Urol， 2014，67（5）： 373-82.

[2] Chen Y， Xin X， Li J， et al. RTK/ERK pathway under natural selection associated with prostate cancer. PLoS One[J]. 2013， 8（11）： e78254.

[3] Nelson WG， De Marzo AM， Isaacs WB. Prostate cancer. N Engl J Med[J]. 2003，349（4）： 366-81.

[4] 林艳端，申锷，胡兵. 三种常见的前列腺癌细胞系LNCaP、PC3、DU145的生物学特性[J]. 中华临床医师杂志， 2013，7（11）：4980-4982.

[5] Muhlbradt E， Ma J， Severi G， et al. Variant NKX3.1 and Serum IGF-1： Investigation of Interaction in Prostate Cancer[J]. Genes Cancer， 2013， 4（11-12）： 535-45.