微生物检测中直接涂片的应用价值

王守祥

【关键词】肛周脓肿厌氧菌直接涂片

【中图分类号】R446.5【文献标识码】B【文章编号】1005-0019（2015）01-0099-01

我院外科有一患者，由于肛门外伤，引起肛周脓肿，外科遂局部穿刺抽出约3毫升粘稠物。穿刺物送检验科微生物检侧。本科接到标本后，肉眼观察粘稠样浓性液，咖啡色，可嗅到异样臭味，立即直接涂片3张，一张革兰氏染色，一张抗酸染色，一张备用、镜检，抗酸染色未找到抗酸菌，革兰氏染色涂片可看到少量的革兰氏阳性球菌，和大量的革兰氏阴性杆菌，杆菌菌体较小，两端圆，有大量白细胞，胞体内有大量吞噬的革兰氏阴性杆菌。这些革兰氏阴性杆菌怀疑是肠道的厌氧菌。随即接种血平板、巧克力平板和中国兰平板，进行二氧化碳、35度培养，因为是基层医院，条件所限，未能进行厌氧培养。

培养24小时后，血平板有灰白色菌落，中等大小，光滑，涂片革兰氏染色为革兰氏阳性球菌，触酶阳性。而巧克力平板和中国兰平板未见细菌和真菌生长。革兰氏阳性球菌分离纯培养，鉴定为溶血葡萄球菌。直接涂片在白细胞内的革兰氏阴性杆菌没有长出，初步确定是厌氧杆菌，继续培养48小时后仍未见长出，基本可以确定为厌氧杆菌。通知临床医生：有两种细菌，阳性球菌和阴性杆菌，以革兰氏阴性杆菌为主，厌氧菌的可能性极大。

治疗效果：静脉滴注抗生素头孢噻肟和替硝唑注射液抗生素联合应用5天，分泌物明显减少，分泌物直接涂片革兰氏阳性球菌找不到，偶有革兰氏阴性杆菌。二氧化碳、35度培养阴性。10天后，脓肿分泌物基本消失。两周后瘘管口闭合。效果明显，说明用药正确。

讨论：

1、 微生物标本细菌培养和直接涂片镜检是细菌学常用的方法，细菌培养特点是结果准确，细菌量较少的情况下也能检测到，可鉴定细菌到种、型，并且能做出药敏结果，缺点是出结果流程麻烦，周期较长，受设备、试剂等条件限制，如苛养菌流感嗜血杆菌杆菌需要v因子x因子；布鲁氏菌初代培养需硫胺、烟酸和生物素，培养基加马血清马铃薯葡萄糖，培养周期5—7天，且这些菌初代培养需要在5—10%二氧化碳环境下培养，对基层医院很难具备比较完善的工作环境条件，很难得到满意的结果。如果是专性厌氧菌采集标本要求绝对与空气隔绝，培养也要在无氧的条件下才可生长。由于标本采集、运输和培养营养环境条件造成苛氧菌和专性厌氧菌可能不生长。本案例因本室不具备厌氧培养条件，革兰氏阴性杆菌没有长出。直接涂片镜检方法简单，快速，成本低廉，革兰氏染色分出革兰氏阳性球菌、革兰氏阳性杆菌、革兰氏阴性球菌、革兰氏阴性杆菌，抗酸染色确定是否为抗酸菌，结合菌体形态特征、标本来源，大致知道标本中有几种细菌，那类细菌，又真菌菌体较大，有的有菌丝，具此可知道有无真菌。缺点是不能进一步鉴定细菌菌种，无法做药敏试验，标本中细菌量少的情况下会漏检，对稀淡的穿刺液需要离心取沉淀物涂片镜检可提高阳性率。除了血标本外，几乎所有的标本都可以直接涂片镜检。目前，结核杆菌的检测用抗酸染色镜检找抗酸菌是微生物检测的主要手段，生殖道淋球菌的检测大多数情况下用还是直接涂片革兰氏染色找革兰氏阴性双球菌，就是因为直接涂片镜检快速简单，立即可取到结果。

2、 标本直接涂片镜检还可以看到白细胞，中性粒细胞和单核细胞在组织部位有炎症时，会向组织移动聚集，与细菌真菌作斗争，这些细胞叫炎细胞。如观察到大量的多型核白细胞和较多细菌则说明是急性感染，这时由于（细菌、真菌）感染早期启动非特异性免疫因子中中性粒细胞是最主要的免疫细胞；如白细胞数量较少并以单个核细胞为主，则说明为慢性感染。标本中白细胞出现是微生物感染的标志，被白细胞内吞噬的细菌往往是主要致病菌，这一点很重要，如果标本培养前发现被白细胞吞噬的细菌，没有培养出，就应对本次培养的结果可靠性产生怀疑，应重新更换思路，有可能是苛氧菌或专性厌氧菌，实验室条件差细菌不生长，也有可能没有及时运送标本或没有及时接种标本，造成细菌死亡而長不出。本案例标本中白细胞内的革兰氏阴性杆菌就是因为本室不具备厌氧菌培养条件未长出，结合标本来源和菌体形态特征，高度怀疑是肠道拟杆菌。深部组织分泌物由专性厌氧菌感染或专性厌氧菌与其它菌混合感染的几率很高，直接涂片镜检显得尤为重要。

3、 直接涂片镜检可以指导临床经验用药，临床经验用药是广泛存在的，细菌培养加药敏周期一般在2—3天，临床医生和病人是不会等到培养的细菌药敏试验结果出来后再进行抗生素用药，特别是急性感染的病人，不能耽误病人的抢救治疗，这时对标本如果直接涂片镜检，根据标本来源、外观、气味，结合菌体的染色、形态特征、细菌的排列方式，大致可以确定是那类细菌，及时反馈给临床医生，指导临床医生经验药。如果是一位经验丰富的经验工作者甚至可以把细菌确定到属、种、型。如浑浊或浓样脑脊液标本离心，取沉渣涂片革兰氏染色阴性、凹面相对球菌可能是脑膜炎双球菌（也不排除其它奈瑟氏菌或卡他补兰汉菌）；革兰氏阳性、有荚膜、矛头状双球菌常为肺炎链球菌；如发现革兰氏阴性小杆菌，且有长丝状，结合临床症状可初步确定为流感嗜血杆菌；用湿片和墨汁混合在暗光下，观察到真菌周围有似一晕轮透明荚膜新型隐球菌；怀疑结核型脑膜炎，抗酸染色找到抗酸杆菌，基本可以确定是结核杆菌。把这些涂片镜检观察到的细菌快速通知临床医生，医生可以针对性地经验用药。

4、 深部组织很适合直接涂片进行筛查。首先，深部组织不与外界直接相通，受污染的机会很小，只要严格无菌技术采样，一般不会被污染，涂片镜检观察到的细菌都有临床意义，作为感染菌看待；其次，深部组织很适合厌氧菌生长繁殖，一旦厌氧菌进入这些组织，即可进行繁殖和损伤组织，由于坏死组织吸收余氧，更有利于大量繁殖，更进一步造成组织损伤、坏死，这种恶性循环必然导致深部组织大量厌氧菌的存在。另外，在厌氧菌感染中，有许多情况是与需氧菌、兼性厌氧菌混合感染。一方面需氧菌耗竭了环境中的氧气，更有利于厌氧菌的生长，另一方面需氧菌与厌氧菌有营养的协同作用，如肠道中，拟杆菌缺乏过氧化物酶，不能解除过氧化氢的毒性作用，与大肠杆菌可提供过氧化物酶，可将过氧化氢分解为水，而有利于拟杆菌生长。目前，在县级以下医院，厌氧菌培养还没有普遍推广，直接涂片镜检无疑是对不能进行厌氧菌培养缺陷的很好补充。