福建三明不同地理种源草珊瑚亲缘关系ISSR分析

邓思珊等

摘要：目的 研究福建草珊瑚基地不同地理種源的草珊瑚遗传多样性，构建亲缘关系图。方法 采用CTAB法提取叶子中DNA，ISSR法对45个种源的草珊瑚样品进行DNA分子水平的分析评价，POPgen32软件计算遗传多样性，建立基因树谱，采用NTSYS软件进行聚类分析。结果 6条ISSR引物共扩增出630条条带，遗传多样性分析表明45个品种平均有效等位基因数为1.620 2，平均Nei's基因多样性指数为0.364 5，平均Shannon信息指数为0.543 2。各位点遗传多样性程度也存在较大差别，Nei's基因多样性指数最大值为0.497 2，最小值为0.1078；Shannon信息指数最大值为0.690 3，最小值为0.219 2。聚类分析结果显示，以45个品种和14个位点的谱带数据为原始矩阵，共获得630个两两不同品种间的遗传相似系数，不同组之间相似系数最大者为1.0，最小者为0.516。结论 福建三明种植的草珊瑚品种间存在丰富的遗传变异，具有丰富品种的分子基础。以0.610为阈值可以把45个不同地理种源的草珊瑚分为6个组。遗传距离与种源地理远近无明显相关。

关键词：草珊瑚；ISSR法；遗传多样性；聚类分析

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.023

中图分类号：R282.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）09-0083-04

ISSR Analysis on Genetic Relationship of Fujian Sanming Sarcandra Glabra of Different Geographical Provenances DENG Si-shan1， LIU Hong-xu1， MENG Chun2， LIANG Yi-chi3， XU Rong-qing1， LIN Wen-jin1， ZHANG Ya-min1 （1.Fujian Academy of Medical Sciences， Fujian Provincial Key Laboratory of Medical Test， Fuzhou 350001， China；2.Fuzhou University， Fuzhou 350108， China；3.Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350108， China）

Abstract：Objective To study the genetic diversity in Fujian Sanming Sarcandra Glabra from different geographical provenances；To construct genetic relationship diagram. Methods DNA in leaves was extracted by CTAB. Analysis and evaluation of DNA molecular level of 45 samples of different geographical provenances were conducted by ISSR method. POPgen32 software was used to calculate the genetic diversity and establish gene trees. NTSYS software was used to carry out cluster analysis. Results Six ISSR primers amplified 630 bands. Genetic diversity analysis showed that the average effective number of alleles of 45 varieties was 1.620 2；the average Nei's genetic diversity index was 0.364 5；the average Shannon information index was 0.543 2. Each point had different levels of genetic diversity. Nei's genetic diversity index of the maximum value was 0.497 2， and the minimum value was 0.107 8；Maximum Shannon information index was 0.690 3， and the minimum value was 0.219 2. Cluster analysis results showed that 45 varieties and 14 loci band data were the primitive matrix. 630 genetic similarity coefficients between two different species were obtained. The maximum similarity coefficient among different groups was 1.0， and the minimum was 0.516. Conclusion Different varieties of Fujian Sanming Sarcandra Glabra exist abundant genetic variation and has the molecular basis of abundant species. Using 0.610 as the threshold value can divide Sarcandra Glabra from 45 different geographical provenances into 6 groups. The genetic distance and geographical distance was not related.

Key words：Sarcandra Glabra；ISSR；genetic diversity；cluster analysis

草珊瑚为金粟兰科植物草珊瑚Sarcandra glabra （Thunb.） Nakai的全株，具有抗肿瘤、抗菌消炎、抑制流感病毒、促进骨折愈合及镇痛等功效。在保健品、日用品等领域也广泛应用，市场需求旺盛。草珊瑚分布在我国以福建、江西为代表的南方各省。福建三明位于武夷山脉与戴云山脉之间的汇水区，气候温和，雨量充沛，土层深厚，森林覆盖率高，是草珊瑚生长的理想区域。近年来，福建三明草珊瑚已形成产业，成为全国最大的人工草珊瑚种植基地，优质种源四五十种，来自当地及福建、江西、浙江、广东、广西。在通过有效成分、生物量考察分析，科学筛选高产、质优的草珊瑚的研究之后[1]，有必要对不同地理种源的草珊瑚进行遗传多样性分析，从分子水平研究种质间的遗传距离，为保护基地种质资源、评价植物道地性和药材品质提供科学依据。

ISSR（inter-simple sequence repeat）是Zietkiewicz等于1994年发展起来的一种微卫星基础上的分子标记[2]。其基本原理是：用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3'端或5'端加上2～4个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的ISSR区域多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性表现。ISSR集随机扩增多态性DNA（RAPD）、SSR技术的优点于一身，实验操作简单、快速、耗资少，遗传多态性高，已广泛应用于作物遗传多样性、种群亲缘关系分析等方面[3-5]。本研究应用ISSR法对三明三元草珊瑚基地不同地理种源的45个草珊瑚样品进行DNA分析评价。

1 仪器与试药

UV-1800型双光束紫外可见分光光度计（日本岛津公司），ABI7300 PCR仪（美国ABI公司），DYCP-34A型电泳槽（北京市六一仪器厂），J-25型离心机（德国HERMAL公司），DYY-10C型电泳仪（北京市六一仪器厂），CTK-50凝胶成像仪（英国SYNGENE公司）。

引物、Mg2+、dNTPs、10×PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、λ-EcoT14I Digest DNA Marker，上海生工生物工程技術服务有限公司；三氯甲烷、异丙醇、乙醇、三水合乙酸钠，西陇化工股份有限公司。

草珊瑚样品于2011年1月福建三明三元区吉口采育场草珊瑚标准示范基地采集，来源信息见表1。摘取幼嫩叶片，阴干后置-20 ℃冷冻保存。样品经福建省药品检验所吴春敏主任药师鉴定为金粟兰科植物草珊瑚Sarcandra glabra （Thunb.） Nakai的全株。

2 方法

2.1 基因组DNA提取

采用CTAB大量提取法。称取0.2～0.4 g新鲜或-20 ℃冷冻植物材料；把植物叶子和研钵一起放入-80 ℃冰冻20～60 min，CTAB放入62 ℃预热；快速研磨叶子直至成粉末状，加入少许预热的CTAB继续研磨，移入预热好CTAB的离心管，置于65 ℃水浴30～45 min，期间摇动几次；12 000×g离心15 min，取上清液转移至新的离心管中；加入等体积氯仿混匀，静置片刻，12 000×g离心10 min；将水相转移至新的离心管中，用等体积氯仿再抽提1次；加入等体积异丙醇，混匀，-20 ℃放置10 min，12 000×g离心15 min；弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，略晾干即可得到DNA粗制品；加入TE缓冲液，放入-20 ℃冰箱保存。

2.2 ISSR-PCR引物设计筛选

根据加拿大British Columbia大学公布的ISSR引物序列进行筛选，获得引物序列，上海生工生物技术公司合成，从100条引物中筛选出6条扩增条带清晰、多态性较高、稳定性良好的引物用于45个样品的扩增，最终确定的引物为801（AT）8T、807（AG）8T、813（CT）8T、824（TC）8G、835（AG）8YC、840（GA）8YT。

2.3 ISSR-PCR扩增条件

对聚合酶链式反应的Taq酶用量、Mg2+浓度、模板DNA用量、磷酸碱基脱氧核苷酸/dNTPs浓度和引物浓度等进行了优化试验。总容积25 μL，包括模板DNA 30 ng，Taq酶20 nkat，0.4 μmol/L引物，2 mmol/L Mg2+，0.250 mmol/L dNTPs，10×PCR buffer 2.5 μL。

扩增程序：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s， 37 ℃复性30 min，72 ℃延伸80 s，40个循环，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。反应结束后，将PCR产物中加入5 μL loading buffer，用4%聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴乙锭染色，凝胶成像仪拍照。

2.4 统计分析

根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，凝胶上相同迁移率位置上有DNA条带记为1，没有DNA条带记为0，得到二元资料，形成0、1矩阵。采用POPgen32分析Nei's基因多样性指数（He）和Shannon信息指数（I）。NTSYS2.10e软件分析所得数据，计算Nei's遗传距离，使用UPMGA法进行聚类分析，构建进化树图。

3 结果

3.1 扩增产物的ISSR多态性

用6条ISSR引物对45个不同地理种源的草珊瑚进行PCR扩增，共扩增出630条清晰条带。稳定的条带片段在250～2000 bp。图1为引物UBC 840对45份草珊瑚ISSR扩增结果。引物序列及多态性分析见表2。通过POPgen32软件对个位点的有效等位基因数（Ne）和及Shannon信息指数进行计算，结果表明，45个产地平均有效等位基因数为1.620 2，平均Nei's基因多样性指数为0.364 5，平均Shannon信息指数为0.543 2。

3.2 草珊瑚种质资源的遗传相似系数和遗传距离

各位点遗传多样性程度存在较大差别，Nei's基因多样性指数最大值为0.497 2，最小值为0.107 8；Shannon信息指数最大值为0.690 3，最小值为0.2192，说明所选的样品间存在丰富的遗传变异，不同产地的草珊瑚具有丰富品种的分子基础。

3.3 聚类分析

用NTSYS软件，以45个样品和14个位点的谱带数据为原始矩阵，共获得630个两两不同种源间的遗传相似系数，不同组之间相似系数最大者为1.0，最小者为0.516。亲缘关系聚类树状图见图2，以0.610为阈值可以把45个不同种源样品分为6个类群。第Ⅰ大类由19个种源组成，包括样品24、10、14、19、12、11、31、25、33、8、26、3、45、37、21、42、22、34和2，第Ⅱ大类由14个种源组成，包括样品29、9、35、44、28、43、13、32、16、38、4、39、6和20，第Ⅲ大类由2个种源组成，包括样品41和27，第Ⅳ大类8个种源组成，包括样品1、36、18、5、40、7、17和15，第Ⅴ大类为样品23，第Ⅵ大类为样品30。其中24和10，12、11、31、25、33、8、26和3，38和4遗传距离高度一致。

4 讨论

草珊瑚是一种重要的药用植物资源，由于市场需求量大，现已无野生资源，人工栽培方式的不同造成草珊瑚具有多样性。笔者参考了多篇有关草珊瑚DNA的实验性文章[6-9]，大都仅停留在DNA提取和分子标记方法研究上，尚未见同一生境不同种源草珊瑚遗传多样性研究报道。本研究样品取自福建三明草珊瑚种植基地，种源来源多，研究其亲缘关系对保护基地种质资源、评价植物道地性具有重要意义。

研究结果表明，试验扩增的ISSR片段多态性很高，不同种源间遗传相似系数变幅较大。各位点遗传多样性程度存在较大差别，Nei's基因多样性指数最大值为0.497 2、最小值为0.107 8，Shannon信息指数最大值为0.690 3，最小值为0.219 2，表明所選的不同地理草珊瑚种源间存在丰富的遗传变异，具有丰富品种的分子基础。同时表明，在长期的人工栽培和定向选择培育过程中，不同地域和育种模式造成草珊瑚的种质变异和进化速率大大高于自然群，造成了DNA分子水平上的多样性，具备较高的遗传变异。无性繁殖技术的推广应用，进一步造成了不同地域性草珊瑚DNA分子多样性的维持。

聚类分析进一步表明，试验所采用的草珊瑚可能主要由2种不同种质的品系发育而来。聚类树状图表明，遗传距离高度一致的样品12（福建华安）、11（浙江金华）、31（福建明溪）、25（福建建阳）、33（福建明溪沙溪）、8（广东梅州）、26（福建沙县南霞）和3（浙江新余）来自不同省份的不同地区，以及24（福建邵武）和10（浙江衢州）、38（福建三明三元曹源）和4（江西赣州）来自不同省份，却有较近的遗传距离。结果表明，福建三明草珊瑚基地的不同地理种源的草珊瑚不能完全反映种源的地理分布特点，不存在种源区域性特点，亲缘关系与产地来源的地理远近距离并无明显关系。不同来源草珊瑚的多态性，为分析中国不同地区草珊瑚的种植历史、种植水平以及建立标准化种质资源圃提供重要参考。分子多态性是否与草珊瑚的有效成分存在关系，有待进一步研究。

参考文献：

[1] 邓思珊，刘洪旭，王全，等.不同产地草珊瑚优良种源筛选研究[J].中国现代应用药学，2014，31（9）：1061-1066.

[2] Zietkiewicz E， Rafalski A， Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR） anchored polymerase chain reaction aplification[J]. Genomics，1994，20：176-183.

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[4] 李喜凤，邱天宝，张红梅，等.蒲公英遗传多样性的ISSR分析[J].中草药，2012，43（10）：2025-2029.

[5] 熊忠臣，史艳财，漆小雪，等.壮药战骨种质资源遗传多样性ISSR分析[J].中草药，2012，43（10）：2040-2044.

[6] 陈瑾，迪丽拜尔·托乎提，郭卫东.五种提取草珊瑚叶片总DNA方法的比较研究[J].新疆师范大学学报：自然科学版，2008，27（1）：87-89.

[7] 张志勇，何平.药用植物草珊瑚RAPD扩增条件优化[J].广西植物，2009， 29（4）：455-458.

[8] 唐美琼，姚绍嫦，李林轩，等.药用植物草珊瑚AFLP反应体系的建立[J].湖北农业科学，2012，51（17）：3879-3881.

[9] 倪开诚，闵芳，郭卫东，等.采用ISSR分子标记进行草珊瑚8个种源的遗传多样性分析[J].中草药，2008，39（9）：1392-1396.

（收稿日期：2015-01-09）

（修回日期：2015-02-02；编辑：陈静）