米糠多糖理化性质研究

陈新，孙维矿，赵玲，刘梁

（武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023）

米糠多糖理化性质研究

陈新，孙维矿，赵玲，刘梁*

（武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023）

通过Molish、Benidick、I-KI等颜色反应研究米糠多糖的理化性质，并运用NMR、HPLC、IR等现代分析手段对米糠多糖的单糖组成、分子量分布、理化性质进行了研究。结果表明米糠多糖中葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖的摩尔比为1.669∶1∶0.225∶1.228，分子量在4.878×105（±0.506%）范围的多糖含量为70.8%，分子量在9.802×104（±3.368%）范围的多糖含量为29.2%。

米糠多糖；理化性质；糖组成；分子量分布

稻米加工中，糙米皮层被碾除得到精白米，同时得到副产物米糠（即被碾下的籽粒的表皮、部分糊粉层、米胚芽和少量破碎胚乳的混合物）［1-2］。米糠重量虽然不足糙米的10%，但糙米中约2/3的营养素存在米糠中，因此，米糠是一种具有很大潜力的优质食品原料［3-4］。米糠多糖存在于稻谷颖果皮层里，是目前尚未被深入开发和广泛应用的主要营养成分之一［5-6］。采用不同的提取工艺可以得到多种米糠多糖，它们都具有显著的生物活性和保健功能，不仅具有一般多糖或膳食纤维所具有的生理功能，而且还具有抗肿瘤、降血糖、降胆固醇和增强免疫等多种生物活性［7-9］。本实验室从米糠中提取、纯化得到米糠多糖，并对其理化性质、单糖组成、分子量分布等参数进行了系统分析和测试，实验结果对米糠的深加工和米糠多糖类产品的研究和开发具有重要的指导意义。

1材料与方法

1.1 试验材料与试剂

米糠多糖（本实验室从米糠中分离纯化所得）；乙醇、丙酮，乙醚、正丁醇、异丙醇、α-萘酚、苯酚、硫酸、柠檬酸钠、无水碳酸钠、结晶硫酸铜、碘、碘化钾、茚三酮、咔唑、三氟乙酸、溴化钾（均为AR）；葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸（均为BR）。

1.2 仪器和设备

安捷伦1026型高效液相色谱仪；NEXUS-670型傅里叶红外光谱仪（美国NICOLET公司生产）；Bruker AV400型双通道全数字化傅里叶超导核磁共振谱仪。

1.3 试验方法

1.3.1 多糖的理化性质

称取25 mg米糠多糖，溶解于超纯水中，定溶于25 mL容量瓶中，得1.0 mg/mL的米糠多糖溶液，待用。

1）溶解性试验：将多糖溶于冷水、热水、乙酸乙酯、乙醇、丙酮，乙醚、正丁醇、异丙醇中，观察其溶解情况。

2）α-萘酚试验（Molish反应）：往试管中加入1 mL 1.0 mg/mL的米糠多糖水溶液，滴入2滴10%的α-萘酚乙醇溶液，混合均匀后将试管倾斜，沿管壁慢慢加入1 mL浓硫酸（勿摇动）。竖直后仔细观察两层液面交界处颜色变化，若在两层交界处出现紫红色的环，表明样品中含有糖类化合物。

3）苯酚-硫酸试验：往试管中加入1.0 mL 1.0 mg/mL的米糠多糖样品水溶液，加入1.0 mL 6%的苯酚溶液，摇匀，并迅速滴加5 mL浓硫酸，静置10 min，振荡摇匀，观察溶液颜色变化。

4）Benedict试验：Benedict试剂的配制，将85 g柠檬酸钠和50 g无水碳酸钠溶于400 mL水中，另将8.5 g结晶硫酸铜溶于50 mL水中，将硫酸铜溶液注入柠檬酸钠溶液中，如溶液不澄清，可过滤去除不溶物。

鉴定操作：往试管中加入1 mL Benedict试剂和0.5 mL 1.0 mg/mL的米糠多糖水溶液，在沸水浴中加热3 min～5 min，冷却至室温，若有红色或黄色沉淀生成，表明样品中含有还原性糖。

5）碘反应：将提取多糖样品配成1 mg/mL的溶液，用淀粉配成1.0 mg/mL作阳性对照，看是否会变蓝色。

6）I-KI反应：用吸管吸取5滴1.0 mg/mL的米糠多糖样品水溶液于点滴板小孔内，加2滴I-KI溶液（IKI溶液配制方法：碘化钾3 g；蒸馏水100 mL；碘1 g。先将碘化钾溶于超纯水中，待全部溶解后再加碘，振荡溶解）以蒸馏水和淀粉溶液作对照。观察颜色变化。

7）茚三酮反应：分别取1 mL浓度为1 mg/mL的多糖样品溶液，加入0.5 mL的0.1%茚三酮乙醇溶液，震荡摇匀，煮沸5 min，冷却，观察颜色变化。以蒸馏水作阴性对照，0.5%氨基酸作为阳性对照。

8）硫酸-咔唑反应：取1 mL浓度为1 mg/mL的多糖样品加入浓硫酸5.0 mL，边加边流水冷却，冷至室温后加入0.15%的咔唑无水乙醇溶液0.20 mL，摇匀，再置沸水浴中加热15 min，观察颜色变化，若有紫色生成，说明多糖样品中含有糖醛酸。

1.3.2 米糠多糖单糖组成的HPLC分析

1.3.2.1 供试品溶液的配制

称取米糠多糖12.5 mg，溶于5 mL 4 mol/L三氟乙酸溶液中，N2封管，100℃水解4 h，减压旋转浓缩蒸干。用水溶解并定溶于10 mL容量瓶中，0.45 μm滤膜过滤，取滤液20 μL进样。

1.3.2.2 对照品溶液的制备

称取葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸7种单糖各10 mg，分别用水溶解并定容于10 mL容量瓶中，即得浓度分别为1.0 mg/mL的各单糖标准溶液。0.45 μm滤膜过滤，取滤液20 μL进样。

分别称取葡萄糖、阿拉伯糖、木糖及半乳糖12.5 mg，混合后用水溶解并定容于50 mL容量瓶中，作为对照品母液。分别从对照品母液中准确移取0.75、1.5、3.0、6.0、7.5、18.75 mL至25mL容量瓶中，配制出浓度分别为30.0、60.0、120.0、240、300、750 μg/mL的对照品溶液。0.45 μm滤膜过滤，取滤液20 μL进样。

1.3.2.3 色谱条件

高效液相色谱仪（备有Varian Prostar 210高压泵，7725Ⅰ型手动进样器，Varian Prostar 500柱温箱，SEDEX 90 LT-ELSD低温型蒸发光散射检测器），色谱柱型号为sugar sp0810 300 mm×8 mm，7 μm，流动相为超纯水（用前经0.45 μm滤膜过滤），柱温箱温度为25℃，流速为1.0 mL/min。米糠多糖及对照品检测时间均为20 min。

1.3.3 米糠多糖分子量的测定

激光光散射法测定多糖分子量原理：激光照射到多糖样品时，会在各个方向产生散射光。SEDEX 90 LT-ELSD低温型蒸发光散射检测器可在18个角度对散射光进行检测，收集散射光的强度。散射光强度与分子量和溶液浓度成正比。散射光角度的变化与分子的尺寸大小有关。高分子溶液的激光散射可基本表示。

式中：K为与溶剂性质和入射光频率相关的常数；c为溶液浓度；R（θ）为不同角度去除溶剂影响后的散射光强度；θ为散射光角度；MW为平均分子量；P（θ）为散射光强度随角度变化的函数；A2为第二维里系数，是溶剂与溶质相互作用的度量，一般溶液极稀时可忽略；n0为溶剂的折射率；dn/dc为折光指数增量，即溶液折射率与浓度变化的比值；N为阿伏加德罗常数；λ为入射光波长；Rg为高分子均方末端距，即链质量中心至各个链段距离平方的平均值。

R（θ）为仪器测定量，K、c、n0、dn/dc、N、λ、θ均为常数或已知量，只有MW、Rg2和A23个高分子链的基本参数为未知值，通过多个角度光散射强度的测定，即可推导求出。

应对保健食品、婴幼儿配方食品、特殊医学用途配方食品等特殊食品进行专柜或专区销售，并设立明显的设立提示牌，注明“****销售专区（或专柜）”字样。

1.3.4 核磁共振测定

多糖样品用D2O配成浓度为25 mg/mL的样品溶液，室温下利用Bruker AV400超导核磁共振谱仪进行测试分析。

2结果与讨论

2.1 米糠多糖的理化性质

米糠多糖冷冻干燥后为白色絮状固体，极易溶于热水，不溶于乙酸乙酯、乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇等有机溶剂，水溶液为无色澄清液体。α-萘酚反应呈阳性；硫酸-苯酚反应亦呈阳性；Benedict试验、碘反应、碘-碘化钾反应、硫酸-咔唑反应、茚三酮反应均呈阴性。表明样品含有多糖，不含还原糖、糖醛酸、淀粉及氨基酸、多肽、蛋白质。

2.2 米糠多糖的单糖组成

米糠多糖的液相色谱图如图2所示，对照品液相色谱图如图1所示。

图1 对照品的液相色谱图（溶液浓度为0.75 mg/mL）Fig.1The HPLC spectrum of the control（The concentration of the solution was 0.75 mg/mL）

图2 米糠多糖的液相色谱图（溶液浓度为1.25 mg/mL）Fig.2The HPLC spectrum of rice bran polysaccharide（The concentration of the solution was 1.25 mg/mL）

通过比较可知，米糠多糖样品液相色谱图中的葡萄糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖的出峰时间与对照品色谱图一致，以对照品中各单糖浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制单糖的标准曲线，计算出米糠多糖中葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖的摩尔比为1.669∶1∶0.225∶1.228。

2.3 米糠多糖分子量测定

样品溶液平行进样3次，正确记录样品保留时间及色谱图，按已知折光仪校正常数和质量回收率设为100%数据处理法计算样品分子量及其分子量分布，实验结果如图3和表1所示。

图3 米糠多糖分子量测定液相色谱图Fig.3The HPLC spectrum of rice bran polysaccharide for molecular weight detected

表1 米糠多糖的分子量分布Table 1The molecular weight distribution of rice bran polysaccharide

2.4 米糠多糖红外光谱分析

红外光谱法是研究有机化合物分子结构的一种重要方法，也是研究糖类化合物结构不可或缺的手段，通过分析各种糖的特征吸收，可以检测糖环的构象和糖苷键的构型。由于糖分子中的官能团主要为羟基和碳氢键，因此，整个光谱的吸收峰较少，而且大多宽而钝，这是由于形成氢键所致。

米糠多糖的红外光谱图如图4所示。

图4米糠多糖的红外吸收光谱Fig.4IR spectrum of rice bran polysaccharide

图4 可看到，3 385 cm-1出现的宽峰是糖分子内或分子间氢键O-H伸缩振动的表现；2 973 cm-1和1 411 cm-1处的吸收峰为C-H伸缩振动和变角振动引起的；以上吸收峰构成了多糖的特征吸收峰。1642 cm-1处为-CHO的C=O伸缩振动峰，1 077 cm-1是C-O振动引起的，这也与前面测定结果相一致，860 cm-1出现的吸收峰表明样品中有α-糖苷键存在。

2.5 米糠多糖核磁共振分析

核磁共振（NMR）对于多糖的结构鉴定起到非常重要的作用。如糖类的化学组成，糖苷键的构型，糖环的构象，糖残基的排列顺序，糖苷键的键合位置等。NMR检测组成有机化合物分子的原子核性质及其与周围化学环境的相互作用，一维核磁共振氢谱（1HNMR）为多糖的结构分析提供很多有用的信息。米糠多糖的1H-NMR如图5所示。

从图5中可以看出δH5.209左右为异头氢，由谱图可以看出异头氢的峰主要有一种；δH4.613为溶剂峰；δH4.091～3.273之间有较多的氢峰，主要是与O相连的氢峰；δH2.035～1.720间的峰主要为-CH2的氢峰。由此可判断样品不含蛋白质。

图5 米糠多糖核磁共振谱图Fig.5HNMR spectrum of rice bran polysaccharide

3结论

运用各种物理、化学分析鉴别手段对米糠多糖的理化性质进行研究。米糠多糖易溶于水，不溶于有机溶剂，同时不含还原糖、糖醛酸、淀粉及氨基酸、多肽、蛋白质等物质。米糠多糖主要由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖及半乳糖四种单糖组成，且葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖的摩尔比为1.669∶1∶0.225∶1.228。米糠多糖分子量在4.878×105（±0.506%）范围的多糖含量为70.8%，分子量在9.802×104（±3.368%）范围的多糖含量为29.2%。

［1］王梅，赵凤敏，刘威，等.米糠多糖的提取分析及应用［J］.中国食物与营养，2010，2（1）：40-43

［2］王仲礼.国外对米糠深加工产品的开发利用［J］.中国稻米，2005（3）：49-51

［3］赵倩，熊善柏，邵小龙，等.米糠多糖的提取及其性质和结构［J］.中国粮油学报，2008，23（3）：4-7

［4］汪艳，吴曙光，周杰，等.米糠多糖的提取纯化及其成分结构和活性分析［J］.生命科学研究，2000，4（3）：273-277

［5］肖云，张迎庆，糜志远.米糠多糖提取纯化工艺的研究进展［J］.食品与药品，2012，14（11）：448-450

［6］陈明，汪善锋.米糠多糖的提取工艺及其生物活性的研究进展［J］.食品研究与开发，2007，128（6）：173-176

［7］刘梁，孙维矿，赵玲，等.米糠多糖的免疫增强作用［J］.食品研究与开发，2014，35（22）：24-27

［8］刘梁，孙维矿，赵玲，等.米糠肽抗氧化活性研究［J］.食品研究与开发，2014，35（22）：28-30

［9］姜元荣，姚惠源，陈正行.米糠多糖的生物活性研究进展［J］.食品科技，2002（10）：66-68

The Study on the Physicochemical Property of Rice Bran Polysaccharide

CHEN Xin，SUN Wei-kuang，ZHAO Ling，LIU Liang*
（School of Biological and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China）

The physicochemical property of rice bran polysaccharide was studied by Molish、Benidick、I-KI color test，and he composition，molecular weight distribution were identified by NMR、HPLC、IR analysis methods.The results showed that the sugar molar composition ratio of glucose，xylose，galactose，arabia in rice bran polysaccharide was 1.669∶1∶0.225∶1.228，and the polysaccharide molecular weight distribution of was 70.8%in 4.878×105（±0.506%），29.2%in 9.802×104（±3.368%）.

rice bran polysaccharide；physicochemical property；composition；molecular weigh distribution

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.09.005

2015-01-27

国家粮食公益性行业科研专项（201313002）

陈新（1978—），男（汉），副教授，博士，研究方向：食品活性物质研究与开发。

*通信作者：刘梁（1981—），男（汉），讲师，博士，研究方向：食品功能因子研究。