HPLC法测定绞股蓝中5种皂苷成分的含量

史美荣，李　华，白　鸽，肖娅萍（药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，西北濒危药材资源开发国家工程实验室，陕西师范大学生命科学学院，陕西西安710062）

HPLC法测定绞股蓝中5种皂苷成分的含量

史美荣，李华，白鸽，肖娅萍*
（药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，西北濒危药材资源开发国家工程实验室，陕西师范大学生命科学学院，陕西西安710062）

目的：HPLC法比较不同地区绞股蓝中人参皂苷Rb1、Rb3、Rd和绞股蓝皂苷XLIX、XVII的含量。方法：采用Shimpack C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，流动相为乙腈和水，流速为0.8mL·min-1，检测波长为203nm，柱温为25℃。结果：采自陕西沣峪口的绞股蓝样品中人参皂苷Rb1、Rb3和Rd的含量最高，约为1.625%，1.776%，0.892%；云南普洱样品所含的绞股蓝皂苷XLIX最高，约为1.75%；重庆北碚区-1的样品中XVII的含量最高，约为1.063%。结论：各地区绞股蓝样品中皂苷含量差异很大。

绞股蓝，人参皂苷，绞股蓝皂苷，HPLC

绞股蓝［Gynostemmapentaphyll um（Thunb.）Makino］为葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物，又名七叶胆［1］，主要分布于我国秦岭和长江流域以南广大地区［2］。绞股蓝中约有皂苷140多种，其中皂苷III、IV、VIII、XII与人参皂苷-Rb1、-Rb3、-Rd、-F2完全相同［3-4］，具有降血糖、降血脂、降血压、增强免疫等药理活性［5-8］。文献报道的绞股蓝皂苷含量分析方法很多［9-14］，但采用HPLC法同时测定绞股蓝药材中人参皂苷Rb1、Rb3、Rd及绞股蓝皂苷XLIX、XVII 5种皂苷类化合物的研究尚未见报道。为了更好地对绞股蓝进行质量评价，从而对其进行深入的开发，本研究建立了同时测定绞股蓝中人参皂苷Rb1、Rb3、Rd、绞股蓝皂苷XLIX、XVII的含量的HPLC方法，并采用该方法比较不同地区绞股蓝中5种皂苷的含量，为绞股蓝的质量控制提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

绞股蓝采自陕西、云南、四川、湖北等地，经陕西师范大学植物教研室田先华教授鉴定为葫芦科绞股蓝属植物绞股蓝［Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino］；乙腈美国fisher公司；正丁醇天津市凯信化学工业有限公司；对照品Rb1、Rb3、Rd、绞股蓝皂苷XLIX、XVII成都曼斯特生物科技有限公司，生产批号分别为13102301、12110603、13041212、13080202、13050301，纯度均≥98.0%；超纯水。

LC-2010高效液相色谱仪及工作站日本岛津公司；Shim-pack C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱日本岛津公司；KQ-300E型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；RE-52AA型旋转蒸发器上海比朗仪器有限公司；AT2201电子分析天平密多利斯科学仪器北京有限公司等。

1.2实验方法

1.2.1对照品溶液的制备精密称取人参皂苷Rb1、Rb3、Rd和绞股蓝皂苷XLIX、XVII对照品13.090、24.200、7.605、19.015、16.225mg，分别用甲醇溶解，并定溶于5mL容量瓶，即制成2.618、4.840、1.521、3.803、3.245mg·mL-1浓度的单一对照品储备液；分别取上述单一储备液200μL，混合后制成质量浓度分别为0.524、0.968、0.304、0.760、0.649mg·mL-1的混合对照品储备液，备用。

1.2.2供试品溶液的制备取不同产地的绞股蓝新鲜全草，晾干，粉碎处理后，经85目的筛子过滤，从中准确称取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇30mL，超声处理（功率250W，频率100kHz）40min，提取液减压蒸干，残渣加水溶解，用水饱和正丁醇萃取两次，合并萃取液，减压蒸干，以甲醇定容至10mL，摇匀，用微孔滤膜（0.22μm）过滤，即得［15］。

1.2.3高效液相色谱条件色谱柱：Shim-pack C18（4.6mm×250mm，5μm）；柱温：25℃；流速：0.8mL·min-1；流动相：A为水，B为乙腈；洗脱条件：0min，35%B；0～20min，35%～40%B；检测波长：203nm；进样量：20μL。

1.2.4标准曲线绘制分别精密吸取“1.2.1”项下的Rb1、Rb3、Rd、XLIX、XVII单一对照品储备液，将Rb1分别稀释成0.13、0.65、1.30、1.95、2.60μg/μL，Rb3分别稀释成0.04、1.20、2.40、3.60、4.80μg/μL，Rd分别稀释成0.076、0.380、0.760、1.140、1.520μg/μL，XLIX分别稀释成0.125、1.250、1.875、2.500、3.750μg/μL，XVII分别稀释成0.053、0806、1.613、2.419、3.225μg/μL，用孔径0.22μm的滤膜过滤后，置于样品瓶中，-20℃冰箱保存备用，按照上述色谱条件进行HPLC测定，作峰面积对浓度的标准曲线，求出直线回归方程。

2　结果与分析

2.1粉末粒度的选择

对不同的粉末粒度，即筛子孔径65、85、120、200目提取效果进行比较。经比较发现当粒度为85目时提取效率最高，因此在后续实验中选用85目的筛子处理样品。

2.2仪器条件的选择

选择乙腈和水作为流动相梯度洗脱进行样品测定。结果表明各样品与其他杂质能够得到很好的分离，如图1所示。

图1　绞股蓝对照品（A）和平利-1（B）色谱图Fig.1　HPLC chromatograms of reference substances（A）and Pingli-1（B）

2.3标准曲线

在规定的色谱条件下，将“1.2.4”项下的各标准液系列进样20μL进行测定，各标准液均有良好的线性关系，其结果如表1所示。

表1　对照品的线性关系（n=5）Table 1　Regression equations of reference substances（n=5）

2.4方法学考察

2.4.1精密度实验取湖北鹤峰供试品溶液，连续进样6次，测定峰面积。结果人参皂苷Rb1、Rb3、Rd、绞股蓝皂苷XLIX、XVII峰面积的RSD（n=6）分别为1.82%、0.83%、1.25%、0.31%、1.01%，表明该方法具有良好的精密度。

2.4.2稳定性实验取湖北竹溪供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样测定各成分的峰面积值。结果人参皂苷Rb1、Rb3、Rd、绞股蓝皂苷XLIX、XVII峰面积的RSD（n=6）分别为1.90%、2.01%、1.32%、0.72%、0.95%，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.4.3重复性实验分别称取陕西平利-1的样品5份，分别测其含量。结果人参皂苷Rb1、Rb3、Rd、绞股蓝皂苷XLIX、XVII的含量平均值（n=5）0.398%、0.639%、0.292%、0.213%、0.766%；RSD分别为1.81%、1.94%、0.77%、2.16%、1.58%，表明该方法重复性好。

2.4.4准确度实验以加样回收率考察准确度。取已知含量（人参皂苷Rb1、Rb3、Rd、绞股蓝皂苷XLIX、XVII）的陕西平利绞股蓝粉末5份，每份0.5g，精密称定，分别精密加入人参皂苷Rb1、Rb3、Rd、绞股蓝皂苷XLIX、绞股蓝皂苷XVII的对照品0.76、0.66、0.96、0.28、1.18mL，按上述色谱条件方法测定，计算五个成分的加样回收率。结果上述5个分析物的平均回收率分别为98.46%、101.63%、102.63%、99.15%、98.48%；RSD分别为0.85%、1.01%、2.32%、1.65%、2.25%，表明该方法具有良好的准确性。

2.5样品测定结果

采用本实验所建立的方法对32批来自陕西，云南，广西等不同产地的绞股蓝样品中人参皂苷Rb1、Rb3、Rd和绞股蓝皂苷XLIX、XVII的含量进行测定，该方法适用于绞股蓝及其制品的测定，结果如表2所示。测定结果表明，32批采自不同地区样品的皂苷成分在组成和含量上存在一定的差异，这种差异可能与地区差异有关。另外绞股蓝植株为雌雄异株，其叶型可分为3、5、7、9，另外其染色体倍数也混杂，这些均可能影响绞股蓝皂苷含量和种类。本实验对样品中的皂苷成分进行相关分析，可为今后绞股蓝皂苷的变化规律以及影响因素方面的相关研究提供理论基础。

表2　32批绞股蓝药材中5种皂苷成分的含量测定结果Table 2　The determination results of the five saponins in 32 samples

3　结论

本实验建立了同时测定绞股蓝中人参皂苷Rb1、Rb3、Rd、绞股蓝皂苷XLIX、XVII含量的HPLC方法，该方法具有分离效果好，回收率好，精密度高，仪器要求不高，灵敏度高的特点。且实验中发现，人参皂苷Rb3在绞股蓝样品中含量高，且结构稳定，故可作为绞股蓝皂苷含量测定的对照品之一，这为多指标控制绞股蓝药材的质量提供了实验基础。

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Quantification of five saponins in Gynostemma Pentaphyllum（Thunb.）Makino by HPLC

SHI Mei-rong，LI Hua，BAI Ge，XIAO Ya-ping*
（Key Laboratory of Ministry of Education for Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry，National Engineering Laboratory for Resource Developing of Endangered Chinese Crude Drugs in Northwest of China，College of Life Sciences，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

Objective：To compare the content of Saponins in Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino from different regions.Methods：The HPLC separation was carried out with a C18column（4.6mm×250mm，5μm）using acetonitrile and water as mobile phase at a flow rate of 0.8mL·min-1.The detection wavelength was 203nm and the column temperature was maintained at 25℃.Results：The material collected from Fengyukou in Shaanxi had the highest content of ginsenoside Rb1，Rb3and Rd，about 1.625%，1.776%，0.892%respectively. The material from Pu’er in Yunnan contained the highest Gyp（Gypenoside）XLIX，approximately 1.75%.The material from Chongqing Beibei-1 had the highest content of Gyp XVII，about 1.063%.Conclusion：There was a significant difference in the content of Saponins in Gynostemma pentaphyllum from the different areas.

Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino；ginsenoside；gypenoside；HPLC

TS255.1

A

1002-0306（2015）02-0049-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.001

2014－04－14

史美荣（1989-），女，硕士研究生，研究方向：药用植物资源。

肖娅萍（1958-），女，博士研究生，教授，研究方向：药用植物资源。

国家“十二五”科技支撑计划课题（660588）。