响应面法优化雨生红球藻虾青素的超声提取工艺

齐计英，姚依婧，岑　琴，韩　静，*，郑士彬

（1.沈阳药科大学，辽宁沈阳110016；2.沈阳产品质量监督检验院，辽宁沈阳110022）

响应面法优化雨生红球藻虾青素的超声提取工艺

齐计英1，姚依婧1，岑琴2，韩静1，*，郑士彬1

（1.沈阳药科大学，辽宁沈阳110016；2.沈阳产品质量监督检验院，辽宁沈阳110022）

以雨生红球藻为原料，选取乙酸乙酯∶乙醇（v/v，1∶1）为提取溶剂，采用超声法提取虾青素，固定液料比为100∶1，以超声功率、超声时间和超声温度为因子，虾青素提取率为评价指标，在单因素实验的基础上，利用响应面法对提取条件进行优化。三因素对虾青素提取率的影响顺序为：时间＞温度＞功率。优化得到的最佳提取条件为：超声功率200W、时间30min、超声提取温度25℃，在此条件下提取率可达1.045%，与预测值1.05%相近，表明模型可用。

雨生红球藻，虾青素，响应面法，超声提取

虾青素是类胡萝卜素的含氧衍生物，属于酮式类胡萝卜素，全称为3，3’-二羟基-4，4’-二酮基-β，β’-胡萝卜素［1］。虾青素具有极强的清除自由基和猝灭活性氧的活性［2-4］，此外，虾青素具有抑制肿瘤发生、增强免疫功能等多方面的生理作用［5］，特别是抗氧化功能超强，被誉为“超级抗氧化剂”，且对人体绝对无毒害作用［6］。虾青素已被广泛应用于食品、医药、化妆品及养殖行业［7］。雨生红球藻（Haematococcus p luvialis）是一种单细胞微藻，隶属绿藻门、团藻目、红球藻科、红球藻属［8］，是自然界天然虾青素含量最高的生物，含量达到干细胞的2%～4%［9］。由于藻细胞壁较厚且存在胶质，加大了虾青素的提取难度，所以寻找简便、高效的提取方法是大规模培养雨生红球藻及其高值商业化必须解决的问题［10］。

目前，国内外学者已对虾青素的提取方法进行大量研究，如微波法［11］、低温研磨萃取法［12-13］、碱提法［14］和加液氮研磨法［12］等［15］。近年来，超声辅助提取技术得到了广泛的应用［16］，其中超声波提取法在中草药化学成分提取［17-18］中已经显示出明显的优势，具有省时、节能、提取率高等优点［19-20］。除了空化和振动作用外，超声波的许多次级效应，如乳化、扩散、化学效应等也能促进植物中有效成分的转移，使其充分和溶剂混合，促使提取进行［21］，现已有超声-正己烷萃取虾青素［22-23］等报道。

本实验采用超声水浴提取法从雨生红球藻孢子中提取虾青素，并在单因素实验基础上采用响应面法（response surface methodology）对超声提取过程中的各因素进行优化，以确定提取工艺方案，提高虾青素提取效果。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）藻粉（＜1.5%）荆州市天然虾青素有限公司；丙酮、乙酸乙酯、无水乙醇、氯仿、二甲基亚砜（DMSO）等均为国产分析纯试剂。

UV2800紫外可见分光光度仪上海舜宇恒平科学仪器；DF-101S型恒温加热磁力搅拌器巩义英峪予华；DZF-1型真空干燥箱北京光明医疗；旋转蒸发仪RE-52上海亚荣生化仪器；SHZ-D循环水式真空泵上海博迅实业；JY 92-2D超声细胞粉碎机宁波新芝生物科技。

1.2实验方法

1.2.1提取溶剂的确定各取100mg藻粉于烧杯中，分别加入5m L丙酮、乙酸乙酯、无水乙醇、乙酸乙酯：无水乙醇（v/v，1∶1）、乙酸乙酯：无水乙醇（v/v，1∶2）、氯仿、氯仿：无水乙醇（v/v，1∶1）、二甲基亚砜；将烧杯固定在20℃水浴锅中，安装超声探头，将探头浸于烧杯溶液中进行100W超声水浴提取30m in；然后进行真空抽滤，将滤液分别用各提取溶剂定容至25m L；取1m L溶液减压浓缩后用DMSO定容至25m L，在492nm波长下测定吸光度。

1.2.2单因素实验按照1.2.1提取方法，取100mg藻粉于烧杯中，在液料比100∶1，温度20℃条件下，置于100、150、200、250、300、350W下超声提取30m in；在功率200W，液料比100∶1，温度20℃条件下，设置提取时间10、20、30、40、50、60m in 6个水平；在功率200W，液料比100∶1，提取时间30min条件下，分别置于10、20、30、40、50、60℃下提取；在功率200W，温度20℃，提取时间30min条件下，分别选取液料比50∶1、100∶1、150∶1、200∶1、250∶1、300∶1共6个水平；各组进行虾青素提取率的测定。

1.2.3虾青素提取率的测定采用二甲基亚砜法［24-25］测定提取液中虾青素含量。雨生红球藻中提取得到总虾青素的浓度C1（mg/m L）：

式中：A492—待测溶液在492nm波长下的吸光值；E—虾青素溶液体积分数为1%、光径为1cm时的吸光值，

计算雨生红球藻中虾青素的提取率C2（%）：

式中：V—定容后提取液的总体积，m L；M—所用雨生红球藻的干重，mg。

1.2.4响应面分析优化提取参数的研究以超声功率（A）、超声时间（B）和水浴温度（C）等因素作为考察对象，以虾青素提取率（Y）为响应值，采用Design Expert 8.0统计分析软件的响应面分析法安排实验，共有17个实验点（中心点重复5次，用于估计实验误差），以获取最适工艺参数。实验水平因素安排见表1。

表1　因素水平表Table 1　The factors and levels

2　结果与分析

2.1提取溶剂的确定

图1　不同有机溶剂的效果Fig.1　Effectof differrentorganic solvents

由图1可知，不同有机溶剂提取相同质量藻粉所得虾青素提取率有明显的差异。虾青素提取率较大的溶剂为二甲基亚砜、乙酸乙酯∶乙醇（v/v，1∶1），提取率分别为0.963%、0.934%；其次为乙酸乙酯和无水乙醇分别为0.79%和0.807%，丙酮（0.648%）最低。考虑到产品中溶剂残留的安全性问题，尽量选用无毒无害溶剂，因此最终选用乙酸乙酯：乙醇（v/v，1∶1）作为最佳提取溶剂。

2.2单因素实验结果

由图2可知，在提取功率为100～200W时，虾青素提取率随功率的增大而升高，这可能是因为对于一定频率和一定发生面的超声波来说，功率越大，声强越大，单位时间内超声产生的空化事件增多，从而有利于提取效果的提高［26］。但在功率超过200W时，虾青素提取率随功率的升高而降低，这是由于超声产生的高能量使虾青素降解或异构化［27］。因此，选取200W为超声提取虾青素的最优功率。

由图3可知，在提取时间为10～30m in时，虾青素提取率随提取时间的延长而提高，但提取时间超过30m in时，虾青素提取率随时间的延长而降低。这是因为提取时间的延长使绝大部分虾青素提取出来；但是，在没有抗氧化剂的溶液系统内，长时间的浸提会诱导产生一系列的化学反应，虾青素结构中-OH发生部分氧化分解，使提取率降低。因此，选取30m in为最佳提取时间。

图2　超声功率对虾青素提取率的影响Fig.2　Effectof ultrasonication power on the yield of ASTA

图3　超声提取时间对虾青素提取率的影响Fig.3　Effect of ultrasonication time on the yield of ASTA

图4　超声水浴温度对虾青素提取率的影响Fig.4　Effectofultrasonication temperature on the yield of ASTA

由图4可知，在提取温度10～20℃时，虾青素提取率随温度升高而升高，这是由于虾青素在提取剂中的溶解度随温度的升高而增加。但超过20℃时虾青素提取率随温度提高而降低，这可能是由于温度升高，不稳定双键在溶液系统产生聚合反应，使虾青素提取率降低。为更好遵循节能原则，选择20℃即可。

由图5可知，当液料比小于100∶1时，藻粉不能完全浸入提取溶剂中；当液料比大于等于100∶1时，藻粉能够完全浸入提取溶剂中，但是随着液料比的增加，虾青素提取率无明显变化，说明液料比对虾青素的超声提取效果没有明显影响。因此，在响应面优化实验中固定液料比为100∶1。

图5　提取液料比对虾青素提取率的影响Fig.5　Effectof solid-liquid ratio againstastaxanthin extraction yield

2.3响应面分析结果

2.3.1响应值结果见表2。

表2　实验设计方案及响应值结果Table 2　Experimentalmatrix and values of observed responses

2.3.2回归方程利用软件对实验结果进行二次多元回归拟合，对表3的数据进行方差分析后得到模型的二次多项回归方程为：Y=1.02+0.019A+0.13B+ 0.079C+7.500E-004AB-7.750E-003AC+0.012BC-0.18A2-0.29B2-0.073C2

2.3.3方差分析的结果由表3方差分析可知，拟合的二次多元方程的p＜0.0001，说明用上述回归方程描述的因变量与全自变量之间的回归效果高度显著。因此可以用此模型对影响虾青素提取率的因素进行分析。由表3可知，B、C、A2、B2对Y的影响高度显著，C2对Y的影响显著；A对Y的影响不显著；AB、AC、BC交互作用不显著。提取因素对虾青素提取率作用强弱的顺序为B＞C＞A。各因素交互作用响应曲面图如图6所示。

由图6可知，响应面等高线曲线越陡，说明实验因子对虾青素的提取效果影响越显著，这和方差分析的结果相一致。同时软件分析得到的复相关系数R2为97.96%，证明该模型拟合程度良好，实验误差小，该模型是合适的。对回归方程求解，得到最优组合为：功率202.00W、时间32.00m in、温度26.00℃。考虑到实验操作可行性，虾青素最优提取条件调整为：功率200W、时间30min、温度25℃，在上述最优条件下实验，重复三次，测得虾青素提取率分别为：1.04%、1.045%、1.05%，取平均值为1.045%，与理论预测值1.05%接近，说明经过优化后的回归方程对提取虾青素进行分析和预测非常可靠。

表3　响应面方差分析Table 3　ANOVA for response surface quadraticmodel

图6　超声功率、时间和超声水浴温度三因素交互作用对虾青素的提取率影响Fig.6　Responsesurface（3D）showing theeffectofultrasonication power（A），extraction time（B），and ultrasonication temperature（C）on the response value of extraction yield

2.4超声法与常规法提取的比较

取两份同样的藻粉，分别按上面响应面优化得到的条件，采用超声方法和传统水浴回流方法提取虾青素，结果见表4。

表4　不同提取方法的比较Table 4　Comparison of differentextractionmethods

从表4中可以看出，超声方法更节能、省时，提取效率远高于传统水浴回流。这是因为藻细胞壁厚，采用一般水浴回流提取，有效成分渗出需要的时间长、温度高，虾青素长时间接触空气比较容易被氧化；而利用超声提取技术，超声波对细胞产生的空化效应和机械效应，将细胞壁及整个生物体破裂，极大加快了提取过程，减少能耗、节时，提取率提高。

3　结论

雨生红球藻中虾青素含量高，是获取虾青素的最好来源，但由于藻细胞壁较厚，且虾青素易被氧化、不适宜高温加热限制了虾青素的提取。实验发现，采用超声波水浴处理更节能、省时，提取效率远高于传统水浴回流。

通过有机溶剂选择实验，得到最佳提取溶剂为乙酸乙酯∶乙醇（v/v，1∶1）；单因素实验得到提取条件为超声功率200W、时间30m in、超声提取温度20℃、液料比100∶1；在单因素的基础上对超声功率、时间、超声提取温度三因素进行响应面优化，得最优工艺条件：超声功率、时间、超声提取温度分别为200W、30m in、25℃。在最优条件下，进行验证实验，结果表明，虾青素提取率可达到1.045%，与理论预测值1.05%接近，表明模型可用，可为虾青素的实际生产提供理论依据。

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Optim ization of ultrasonic extraction technology of astaxanthin from Haematococcus Pluvialis

QI Ji-ying1，YAO Yi-jing1，CEN Qin2，HAN Jing1，*，ZHENG Shi-bin1
（1.Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China；2.Shenyang ProductQuality Supervision and Inspection Institute，Shenyang 110022，China）

Haematococcus p luvialis powderwas used as raw material，ethylacetate and ethanol（volume ratio 1∶1）was selected as the best extraction solvent.Taking astaxanthin yield as the evaluation index and ultrasound power，extraction time，and extrac tion temperature as the factors，and fixing radio of solution to material 100∶1，the ultrasound method for extracting astaxanthin was researched.And then，based on the sing le factor experiment，the op timum cond itions to ultrasound extrac ting astaxanthin from Haematococcus p luvialis were got by response surface methodology.The results showed that the effect of the extraction cond itions was time＞tem perature＞ultrasound power，and the op timum extraction conditions were ultrasound power 200W，time 30m in，tem perature 25℃.Under this condition，the extraction rate could reach 1.045%and the content of astaxanthin in Haematococcus p luvialis was 1.05%.The op tim ized modelby RSM agreed wellw ith p ractice.

Haematococcus p luvialis；astaxanthin（ASTA）；response surface methodology；ultrasonic extraction

TS202

B

1002-0306（2015）06-0313-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.060

2014-06-18

齐计英（1988-），女，硕士研究生，研究方向：药物制剂。

韩静（1967-），女，博士，教授，研究方向：纳米技术制药。

辽宁省沈阳市科学技术局（F13-311-4-00）。