响应面法优化超声提取芦笋总皂苷

揭　晶，孙桂芝，刘冬琳，张勇钢

（武汉生物工程学院制药工程系，湖北武汉430415）

响应面法优化超声提取芦笋总皂苷

揭晶，孙桂芝，刘冬琳，张勇钢*

（武汉生物工程学院制药工程系，湖北武汉430415）

利用响应面法对超声提取芦笋总皂苷的工艺进行优化。实验研究了超声条件下影响芦笋总皂苷得率的因素，包括乙醇浓度、料液比、超声时间、超声温度，并通过响应面法优化提取工艺。根据中心组合设计原理采用三因素三水平的响应面分析法，得出了超声提取芦笋总皂苷的最佳工艺条件为：料液比1∶15（W/V），乙醇浓度74%，超声时间54min，超声温度50℃，此时芦笋总皂苷得率为13.06%，接近于模型预测值13.18%。

响应面法，超声提取，芦笋，总皂苷

芦笋系百合科天门冬属多年生宿根性草本植物，是世界十大名菜之一，质地鲜嫩，享有“蔬菜之王”的美称［1-2］。现代研究表明，其主要成分为甾体皂苷类，具有较强的生理和药理活性，包括抗肿瘤、降血脂、抗衰老、抗疲劳、免疫调节等作用［3-4］。

目前对芦笋总皂苷提取进行研究的方法主要有两种，即溶剂浸提法［5-6］和超声波辅助提取法［7-9］。溶剂浸提法提取时间长、操作繁琐。超声提取技术作为一种中药提取的新技术，具有省时、高效、能耗低等优点，其在中药提取工艺中的应用越来越受到关注。已有报道［10］采用这两种方法对芦笋老茎中皂苷进行提取，结果表明超声法比浸提法的提取量提高了29.3%。本研究于国内首次采用较高超声功率（600W）对芦笋总皂苷进行提取，以总皂苷得率为评价指标，采用单因素实验和Box-Behnken响应面法优选芦笋总皂苷的最佳提取工艺。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

芦笋武汉新辰食品有限公司提供的新鲜芦笋茎，由武汉生物工程学院制药工程系生药教研室殷丹博士鉴定，洗净切段晾干，于60℃烘干，粉碎过60目筛，备用；菝葜皂苷元对照品国药集团化学试剂有限公司，纯度98%，批号20100710；乙醇、甲醇、高氯酸国产分析纯；蒸馏水。

HN22-600C型超声波清洗机上海汗诺仪器有限公司；HHS4S型电子恒温不锈钢水浴锅上海光地仪器设备有限公司；TU-1810型紫外分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；ZBY-26型商用制冰机江苏白雪电器股份有限公司；BS124S型电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.2实验方法

1.2.1标准曲线的制作采用高氯酸法［7］。芦笋中的甾体皂苷类化合物是抗癌的主要成分，其水解产物是菝葜皂苷元［11］，所以选择菝葜皂苷元作为对照品。由于菝葜皂苷元没有紫外吸收，所以选择高氯酸作为显色剂，间接测定芦笋总皂苷的含量。准确称取菝葜皂苷元对照品5mg，置于10m L容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，备用。精密吸取对照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7m L，置于10m L具塞试管中，水浴挥干溶剂，加高氯酸5m L，摇匀，65℃水浴15min，取出后于冰水浴中冷却5m in，于311nm处测定吸收度。

1.2.2芦笋总皂苷的提取及测定精密称取2g芦笋粉末，置于250m L锥形瓶中，加入一定浓度的乙醇适量，控制超声功率600W，超声频率40kHz，在一定的温度条件下超声提取。然后将粗提液置于500m L圆底烧瓶中用旋转蒸发仪蒸干，再用甲醇溶解，过滤，所得滤液以甲醇定容至100m L，备用。吸取芦笋总皂苷提取液0.1m L置于10m L具塞试管中，按标准曲线测定方法，测定其吸收度。根据标准曲线回归方程计算总皂苷含量，并代入下列公式求出总皂苷得率。

1.2.3单因素实验设计以总皂苷得率为评价指标，固定乙醇浓度70%、料液比1∶15（g/m L）、超声时间50m in、超声温度50℃，考察不同的乙醇浓度（40%～90%）、料液比（1∶10～1∶35）、超声时间（10～60min）、超声温度（40～80℃）对芦笋总皂苷得率的影响。通过单因素实验选出对芦笋总皂苷得率具有显著影响的因素，并确定其实验水平值。

1.2.4响应面实验设计根据Box-Behnken实验设计原理，选择影响芦笋总皂苷得率（Y）的3个主要影响因素：乙醇浓度（X1）、超声时间（X2）、超声温度（X3）进行组合，以-1、0、1代表因素水平，实验因素及水平编码见表1。

表1　Box-Behnken设计因素水平及编码Table 1　Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5数据处理采用Design-Expert 8.0软件对实验数据进行回归分析，拟合二次多项式方程。

2　结果与分析

2.1标准曲线的绘制

以菝葜皂苷元质量（μg）为横坐标，吸收度A为纵坐标，绘制标准曲线，如图1，得回归方程y=0.0022x+ 0.0277，R2=0.9982，结果表明在102～357μg范围内呈现良好的线性关系。

2.2单因素实验结果

2.2.1乙醇浓度的影响由图2可知，芦笋总皂苷得率在乙醇浓度为70%时最高。乙醇浓度小于70%时总皂苷得率随浓度的升高而升高，在60%后上升较快，这是因为高浓度乙醇有利于醇溶性的皂苷类物质溶出。乙醇浓度超过70%后总皂苷得率随乙醇浓度的升高反而降低，这是因为甾体皂苷易溶于稀醇，过高浓度的乙醇不利于甾体皂苷类物质溶出。因此乙醇浓度选取70%为宜。

图1　菝葜皂苷元标准曲线Fig.1　Standard curve of Sarsasapogenin

图2　乙醇浓度对总皂苷得率的影响Fig.2　Influence of ethanol concentration on the extraction yield

2.2.2料液比的影响由图3可知，料液比1∶15之前，总皂苷得率随着料液比的增加而增加，这是因为溶剂量增大使得总皂苷溶出量增加。料液比超过1∶15后，总皂苷得率略有下降，可能是其他杂质成分竞争性溶出不利于皂苷提取。总体趋势变化不大，由此可知料液比在1∶10～1∶35范围内对芦笋总皂苷得率影响不显著。因此料液比选取1∶15为宜。

图3　料液比对总皂苷得率的影响Fig.3　Influence of solid-liquid ratio on the extraction yield

2.2.3超声时间的影响由图4可以看出在10～50m in范围内，总皂苷得率随着时间延长而不断增加，50m in后呈现下降趋势。这是因为50m in时，芦笋总皂苷提取液达到平衡，此时总皂苷得率最高。提取时间继续延长会增加杂质成分的溶出，得率反而降低。因此超声时间选取50m in为宜。

图4　超声时间对总皂苷得率的影响Fig.4　Influence of ultrasonic time on the extraction yield

2.2.4超声温度的影响由图5可以看出在低温下，芦笋总皂苷溶出较慢，当温度逐渐增大时，总皂苷随之溶出加快；当温度超过50℃后，总皂苷的含量反而减少，可能是由于高温促使皂苷成分分解，使得皂苷成分被破坏，含量下降。因此超声温度选取50℃为宜。

图5　超声温度对总皂苷得率的影响Fig.5　Influence ofultrasonic temperature on the extraction yield

2.3响应面法优化芦笋总皂苷提取工艺

2.3.1响应面分析实验方案与结果根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，综合单因素实验结果，考虑到料液比在1∶10～1∶35范围内对芦笋总皂苷得率影响不显著，所以选取乙醇浓度、超声时间、超声温度3个因素，实验方案及结果见表2。

表2　响应面实验方案及结果Table 2　Projects and results of response surface experiments

2.3.2拟合回归方程的建立采用Design Expert 8.0软件对各因素进行多元线性回归拟合，得二次多项回归模型方程：Y=12.78-0.98X1+0.51X2-0.015X3-0.17X1X2+0.10X1X3-0.08X2X3-0.82X12-0.86X22-1.23X32。回归方程的方差分析结果见表3。

表3　回归方程的方差分析结果Table 3　Analysis results of response surface experiments

从表3可以看出整体模型达到极显著水平（p＜0.01），一次项X1、X2和二次项X12、X22、X32均达到极显著水平（p＜0.01），表明实验因子对响应值不是简单的线性关系。由表3知失拟项不显著（p＞0.05），表明该方程对实验拟合情况好，实验误差小。回归方程的相关系数R2=0.9860，表明模型拟合程度良好，可用该模型对未知条件下总皂苷得率进行预测。该模型的变异系数（C.V.%）为1.92%，在可接受范围内，其值越小，重复性越好。由F值的大小可以推断，在所选择的实验范围内，3个因素对总皂苷得率的影响程度大小顺序依次为：乙醇浓度（X1）＞超声时间（X2）＞超声温度（X3）。

2.3.3响应曲面分析响应面图形是响应值对各实验因素所构成的三维空间的曲面图，从响应面分析图上可以找出最佳参数以及各参数之间的相互作用。采用Design Expert 8.0软件处理后的三维响应面图见图6～图8。

从图6可以看出，固定乙醇浓度不变，随着超声时间的延长总皂苷得率增大，超声时间为53m in时，总皂苷得率达到最大值，继续延长时间则得率反而降低。固定超声时间不变，随着乙醇浓度的增加，提取率呈先增加后降低的趋势。产生以上现象的原因可能是因为高浓度乙醇和长时间超声使得样品中的杂质竞争性溶出，导致皂苷的溶出量降低。乙醇浓度对响应值的影响大于提取时间。

图6　乙醇浓度和超声时间交互作用响应曲面图Fig.6　Response surface of ethanol concentration and ultrasonic time on the yield of total saponins

由图7可以看出，固定乙醇浓度不变，随着超声温度的升高，总皂苷得率先增加后降低，当超声温度为50℃，总皂苷得率达到最大值。固定超声温度不变，随着乙醇浓度的增加，提取率呈先增加后降低的趋势。乙醇浓度对响应值的影响大于超声温度。

图7　乙醇浓度和超声温度交互作用响应曲面图Fig.7　Response surface of ethanol concentration and ultrasonic temperature on the yield of total saponins

由图8可知，超声时间和超声温度之间交互作用不显著。随着超声时间的延长，总皂苷得率先增加后降低，当超声时间为53m in时，总皂苷得率达到最大值。随着超声温度的升高，总皂苷得率先增加后降低，当超声温度为50℃时，总皂苷得率达到最大值。这是因为超声时间适当延长、超声温度适当升高是有利于皂苷成分溶出，但超声时间过长、超声温度过高，杂质成分大量溶出导致总皂苷得率反而降低。

图8　超声时间和超声温度交互作用响应曲面图Fig.8　Response surface of ultrasonic time and ultrasonic temperature on the yield of total saponins

2.3.4皂苷最佳提取条件的确定和验证通过软件对回归方程进行分析处理，获得最优工艺参数为：乙醇浓度73.69%，超声时间53.63min，超声温度49.56℃。为了验证响应面法的可靠性，在优化条件下重复实验3次。考虑到实际操作的可行性，实际操作中取值为乙醇浓度74%，超声时间54min，超声温度50℃。三组总皂苷得率分别为12.89%、13.12%、13.17%，平均值为13.06%（RSD=1.49%），实验值与预测值（13.18%）非常接近，表明所建立的模型具有良好的预测性，优选的工艺条件重复性良好。

3　结论

在单因素实验的基础上，通过Design Expert软件采用Box-Behnken响应面分析法对芦笋总皂苷提取工艺进行设计并优化。研究结果表明乙醇浓度、超声时间和超声温度对芦笋总皂苷得率的影响不是简单的线性关系。在超声功率600W，超声频率40kHz，料液比为1∶15的条件下，本实验确定了超声法提取芦笋总皂苷最佳提取工艺参数为：乙醇浓度74%，超声时间54m in，超声温度50℃，芦笋总皂苷得率为13.06%。说明该模型可以较好的预测芦笋总皂苷提取条件与得率之间的关系，同时也证明了响应面法优化芦笋总皂苷的提取工艺参数的可行性。

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Optim ization ultrasonic extraction process of totalsaponins from Asparagus officinalis L.by response surface methodology

JIE Jing，SUN Gui-zhi，LIU Dong-lin，ZHANG Yong-gang*
（Departmentof Pharmaceutical Engineering，Wuhan Institute of Bioengineering，Wuhan 430415，China）

To op tim ize the ultrasonic extraction technique for the total saponins from Asparagus officinalis L.by response surface methodology.The effect fac tors on the yield of total saponins from Asparagus officinalis L. were stud ied w ith ultrasonic cond ition，inc lud ing ethanol concentration，solid-liquid ratio，ultrasonic time，ultrasonictem perature.Theop tim izedextractionp rocesswasfoundthroughtheresponsesurface methodology.Accord ing to the p rincip le of central composite design w ith the response surface methodology of three factors and three levels，the op timum ultrasound extraction technology was as follow ing：solid-liquid ratio 1∶15（W/V），74%ethanol，ultrasonic time 54m in，ultrasonic tem perature 50℃.Under the conditions，the extraction yield of the total saponins of Asparagus officinalis L.was 13.06%，which was wellmatched w ith the p red ictive extraction yield 13.18%.

response surface methodology；ultrasound extraction；Asparagus officinalis L.；totalsaponins

TS255.1

B

1002-0306（2015）06-0309-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.059

2013-11-25

揭晶（1980-），女，硕士研究生，讲师，研究方向：中药提取和中药制剂。

张勇钢（1979-），男，硕士，讲师，研究方向：中药制剂研究。

2013国家自然科学基金资助项目（31302144）；湖北省自然科学基金项目（2012FFB05201）；2012年度湖北省高等学校青年教师深入企业行动计划项目（XD2012501）。