分子标记技术在植物CMS中的研究与应用

龚秋菊

摘 要：植物细胞质雄性不育是广泛存在于高等植物中的一种生物现象，利用CMS系及其恢复系，在育种上存在巨大的应用价值。不同的分子标记技术已被广泛应用到植物的CMS研究中，从而发掘与CMS密切相关的细胞质基因。同时，利用分子标记辅助育种开发与恢复基因连锁的分子标记，对提高育种效率有重要意义。本文就分子标记技术在植物的CMS研究进展进行概括论述。

关键词：CMS；分子标记；线粒体；恢复基因

中图分类号：S188 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.10.003

Abstract： Cytoplasmic male sterility is one of the biological phenomenon widespread in higher plants. Using CMS lines and its restorer lines has a huge application value in breeding. In order to excavate the cytoplasm genes that closely associated with CMS， different molecular marker technology has been widely applied to CMS studies. At the same time， using molecular-marker assisted selecting technology to exploit the molecular markers which interlock with the restoring genes， has an important significance to improve the efficiency of breeding. This paper summarized a review focusing on the progress on molecular marker technology in plant CMS.

Key words：CMS； molecular markers； mitochondrion； restorer gene

植物细胞质雄性不育系（cytoplasmic male sterility，CMS）最早是由Jones等于1936年首次在洋葱中发现的一种生物现象，广泛存在于高等植物中，其遗传方式属于母系遗传[1]。植物CMS是指雌蕊发育正常、雄蕊发育不正常且不能产生正常功能花粉的现象。已有的研究结果主要集中在两个方面：一是细胞质线粒体和叶绿体基因组结构、转录、翻译方面的差异与CMS的关系；二是恢复基因的调控。随着生物技术的发展，分子标记技术已被广泛应用于植物CMS的研究，并发掘出与CMS密切相关的细胞质基因片段[2-5]。

1 线粒体与CMS的关系

根据前人的研究结果来看，研究者普遍认为导致植物CMS的主要因素与细胞质遗传物质，尤其是线粒体基因组有关。目前对细胞质不育形成机理公认的观点主要有两种：一种是细胞质中线粒体与叶绿体基因组发生基因突变、重排，导致基因编码的蛋白质丧失功能从而引起不育；另一种是线粒体基因重排的产物会阻碍花粉的正常发育，最终导致CMS。目前对线粒体基因与植物CMS关系的研究主要集中在以下几个方面：（1）线粒体基因发生插入、缺失等基因突变；（2）线粒体基因组发生重排产生新的开放阅读框；（3）线粒体RNA编辑异常；（4）线粒体能量代谢相关基因异常。

高等植物线粒体基因组不仅数量大（200～2 500 kb之间），而且结构复杂，主要以线型、开环、闭环、超螺旋等形式存在。并且线粒体基因组含有大量的正向重复序列、反向重复序列、非编码序列和一部分未知来源的序列。线粒体基因组结构的复杂多样性导致线粒体基因组极易发生重排、插入、缺失等突变。由于线粒体是细胞供能的主要场所，并且参与细胞分化、细胞凋亡、细胞信息传递等过程，这些过程任何一步发生异常都会导致线粒体功能异常，从而导致CMS的发生。目前，在水稻[6]、玉米[7-8]、棉花[9]、矮牵牛[10]、小麦[11]等多种植物的CMS研究中，已确定多个与CMS密切相关的胞质基因。

2 常用的分子标记技术

2.1 分子标记技术简介

分子标记（molecular marker）技术是指能够直接反映生物个体或种群间遗传物质差异性的特异DNA片段，是直接以核苷酸序列变异为基础的遗传标记。随着分子生物技术的发展，已有十余种分子标记技术被用于基因克隆与定位、基因库构建、物种亲缘关系鉴定、分子标记辅助育种及遗传多态性分析等方面的研究。

分子标记具有很多特点，如：（1）遗传多态性丰富，稳定性强；（2）可以在不破坏遗传物质结构，不影响基因表达的情况下揭示DNA的变异；（3）操作简便快捷；（4）便于隐性性状的选择；（5）可检测生长发育的不同阶段及不同组织，分布均匀。根据分子标记的特点，通常将其分为以下几类：（1）以分子杂交为基础的分子标记，主要有RFLP；（2）以PCR为基础的分子标记，其中以随机引物PCR为基础的分子标记技术有RAPD标记，以特异引物PCR为基础的分子标记技术有SSR、ISSR、SRAP、SCAR等标记；（3）基于PCR与限制性酶切相结合的分子标记，其中通过对限制性酶切片段的选择性扩增来表现多态性的分子标记，代表有AFLP标记。通过对PCR扩增片段的限制性酶切来表现多态性的分子标记，代表有CAPS标记[12]。

2.2 常用的分子标记技术种类

2.2.1 限制性片断长度多态性（RFLP） 限制性片断长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）最早是由Grodzicker于1974年提出的，此技术是以DNA-DNA杂交为基础的遗传标记。其基本原理是：用特定的限制性内切酶对生物基因组DNA进行酶切，获得大小不同的酶切片段，通过凝胶电泳分离后进行转膜，用目的基因探针与酶切片段进行Southern杂交，通过显影技术得到特异片段的RFLP图谱。由于基因突变、重组等导致酶切位点的改变或酶切片段大小的改变均能形成RFLP多态性图谱[13-14]。其优缺点如下。RFLP标记技术作为一种常用的分子标记方法，具有很多优点，如：（1）不受环境条件、组织特异性及显隐性因素的影响；（2）标记位点在数量上没有限制；（3）结果丰度高，稳定性好，结果可靠。缺点：（1）所需要的DNA含量较多纯度较高；（2）操作繁琐，周期长，成本较高；（3）同位素探针也可能对人和环境造成损伤等[15]。

2.2.2 随机扩增多态性DNA（RAPD） 随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphisms DNA，RAPD）是由Wiliam和Welsh等人于1990年在PCR技术基础上发展而来的一项新的分子标记技术。其基本原理是：利用长为8～10 bp的随机引物对基因组DNA进行PCR扩增，针对特定的基因型，由于每个引物都有与其特异结合的DNA位点，如果发生碱基插入、缺失、替换等突变，会导致特异结合位点的改变，通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物，就会得到DNA片段长度或数量的改变，从而检测DNA片段的多态性[16-18]。RAPD标记技术与RFLP相比有以下优点：（1）对DNA含量要求不高；（2）操作简便、快捷，成本低；（3）能反映出整个基因组的多态性，具有较高的丰度；（4）引物可以适用于不同生物个体不同基因组结构的检测。缺点：（1）稳定性不高，重复性较差；（2）不能鉴别纯合与杂合基因；（3）有很大的变异性，近亲关系的物种间也可能产生极大差异[19-20]。

2.2.3 特征序列扩增区域（SCAR） 序列特征性扩增区域（sequence-characterized amplified region，SCAR）是首先由Parar和Michlmore提出的一种分子标记技术，它是在RAPD技术的基础上发展起来的。其基本原理是：先对基因进行RAPD分析，将目标RAPD片段进行克隆和测序，根据原RAPD片段两端序列设计特异引物并进行PCR扩增，其中引物通常是在RAPD引物的5端与3端延长14个碱基，长度为24 bp。目的是为了鉴别与原RAPD片段相对应的单一位点[21]。该技术与RAPD技术相比具有以下优点：（1）检测结果稳定性好，重复性强；（2）显性遗传，直接根据有无扩增产物检测；（3）操作简便快捷[22]。

2.2.4 扩增片段长度多态性（AFLP） 扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是由荷兰科学家Vos等[23]创建的一种新型的分子标记，它同时结合了RFLP与RAPD技术的特点。其基本原理是：用两种限制性内切酶对基因组DNA进行充分酶切，产生大小不同的DNA限制性片段，将双链人工接头与酶切片段进行连接，作为PCR扩增模板。用含有人工接头互补序列、限制性内切酶识别序列、3端选择性碱基的引物对模板进行预扩增与选择性扩增，只有引物的选择性碱基与限制性酶切位点侧翼的3个核苷酸配对，才能扩增出产物，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，根据有无DNA指纹检测多态性。其优缺点：AFLP结合了RFLP和RAPD两种分子标记技术的特点，具有多态性强、分辨率高，效率高、稳定性强的优点。但是该技术对DNA的纯度与含量要求很高，不同材料需要不断摸索最适的操作条件，并且酶的费用较昂贵。尽管AFLP标记技术产生比较晚，但被普遍认为是一种理想有效的分子标记技术。已被广泛应用于水稻[24]、茶树[25]、小麦[26]、辣椒[27]等多种作物的研究应用上。

2.2.5 SSR分子标记 简单重复序列（simple sequence repeat，SSR） 标记技术最早是在1989年由Litt等[28]建立的。SSR又称微卫星DNA，它是由1～6 bp的核苷酸为单位串联重复组成的一段核苷酸序列，一般常见（CA）n和（TG）n串联的双核苷酸重复序列。SSR广泛存在于基因组的各个座位上，其两端的侧翼序列多是保守的单拷贝序列，由于重复单位数量的不同会造成多态性发生。其基本原理是：根据SSR两端保守序列设计特异引物，PCR扩增微卫星DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出串联重复数不同导致的PCR产物大小不同的多态性片段。其优点有：（1）所需DNA量少；（2）呈共显性遗传，可鉴别纯合基因和杂合基因；（3）可检测到单一的多等位基因位点，稳定性强。缺点：（1）SSR标记数量有限，开发引物难度大；（2）建立和筛选基因组文库较费时。

3 分子标记技术在CMS中的应用

杂种优势（heterosis）是生物界中普遍存在的一种现象，它是指两个遗传性状不同的亲本杂交，产生的杂种一代继承了其父母本的不同优势，在生活力、繁殖力、抗逆性、质量和产量等方面超过其双亲的现象[29]。利用CMS系及其恢复系，不仅可以省去人工去雄的繁琐工作，而且为研究核质遗传互作交流提供有价值的研究模型。因此CMS是杂种优势利用的基础，国内外研究者广泛将分子标记技术应用于多种作物的CMS研究，从遗传学、生理生化等方面深入到分子水平。早在1976年，Levings等[30]率先将RFLP标记技术应用于玉米的CMS研究中，并筛选得到与玉米CMS相关基因。随后，在水稻研究中，1994年，许仁林等[31]利用AP-PCR方法对6个水稻品种线粒体进行扩增，发现在不育系及F1代中与不育相关的特异片段。凌古元等[32]运用AFLP技术对野败型水稻不育系、保持系及杂种F1代线粒体DNA进行比较分析，找出与不育相关的三条差异条带，分别是ZA1、ZA2、ZA3。2002年，利用RAPD技术筛选出与水稻CMS相关的长为1 600 bp的特异片段[33]。在小麦中也均发现不育系与保持系mtDNA之间的差异，运用RFLP技术对3种小麦不育系（T、K、V型）的mtDNA进行对比，结果三者的mtDNA在结构上存在显著差异，并且与其共同的保持系相比也有显著不同[34]。黄占景等[35]利用RAPD技术，发现T型小麦不育系与保持系之间表现出多态性，其中有10个单引物和一组双引物。随后利用RAPD技术对小麦不育系89AR、保持系原冬3号及保持系的mtDNA进行比较研究，结果不育系与保持系间差异显著，并推测这些差异与不育相关[36]。在棉花中，王学德[37]以哈克尼西棉CMS系及其保持系为材料，对其mtDNA和蛋白质进行SDS-PAGE、RFLP、RAPD分析，结果RAPD分析发现不育系和保持系线粒体基因组间存在明显差异，以4个mtDNA探针进行RFLP分析，不育系mtDNA缺失一段1.9 kb的coxⅡ同源序列。蛋白质比较发现不育系中缺失一条分子量为31 kD的多肽，结果将这种coxⅡ基因的突变与蛋白质的缺失联系在了一起。

4 分子标记在不育恢复基因方面的应用

传统的育种方法在选育恢复系材料时，主要依赖于植物的表型进行选择，需要通过连续多代回交并在开花期才能鉴别植株育性，这样不仅费时费力，而且会受到环境条件影响。在长期的育种实践和分子生物学发展的基础上，分子标记辅助育种选择技术（molecular-marker assisted selecting，MAS）已不断运用到鉴别不育恢复系材料中，其基本原理是借助与目的基因紧密连锁的DNA标记，达到选择目标性状的目的，能快速准确地对材料进行选育，极大地缩短了育种周期，提高了育种效率。应用于分子标记辅助育种的标记方法主要有RAPD、RFLP、SSR、AFLP等。

高等植物CMS的产生是受到细胞核与细胞质遗传物质的共同作用结果，因此标记CMS恢复系的核恢复基因（Rfs）在育种过程中也至关重要。在棉花中，Lan等[38]发现一个与育性恢复基因Rf1有连锁关系的RAPD标记UBC6592；Zhang等[39]利用AFLP标记技术筛选得到两个与Rf3紧密连锁的标记，CAPSE3P1和SCARE12M7。在油菜中，刘平武等[40]从可育池与不育池中利用RAPD、SSR、AFLP等标记技术进行筛选，获得与Rfp基因紧密连锁的2个分子标记。在水稻中，Tan等[41]筛选出2个与育性恢复基因紧密连锁的RFLP标记；景润春等[42]筛选出水稻野败型细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的ISSR标记UBC-835。在大豆中，王青山等[43]利用AFLP标记技术从恢复系中得到一段长310 bp的特异片段，并将其转化为SCAR标记。

5 展 望

综上所述，分子标记技术被广泛用于植物CMS的研究中，并发挥重要作用。通过从分子水平对不育相关基因进行探索，以及对恢复基因定位等方面研究均取得了很大进展。但是这些研究远不能满足现代育种的需求，由于植物CMS及其育性恢复现象形成过程具有复杂多样性，以及环境因素对其形成有很大影响，因此，植物CMS不育相关基因的机理还有待于进一步探索。随着现代分子生物学技术的发展，各种新技术也不断被开拓创新，分子标记技术也日臻完善。从与CMS相关基因的分子标记与定位等分子水平研究植物CMS分子机理，也会更准确、有效地用于CMS相关基因的定向育种，从而加快育种的进程。

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