红皮糙果茶种子生活力测定与发芽试验

李　薇，梁　庆，张　潮，苏丹萍,3，贺　涛,4，崔大方

（1.华南农业大学 林学与风景园林学院，广东 广州 510642；2.广东省乐昌林场，广东 乐昌 512219；3.南宁市人民公

园，广西 南宁 530012；4.广州南沙明珠湾区开发有限公司，广东 广州 511455）

红皮糙果茶种子生活力测定与发芽试验

李薇1，梁庆2，张潮1，苏丹萍1,3，贺涛1,4，崔大方1

（1.华南农业大学 林学与风景园林学院，广东 广州 510642；2.广东省乐昌林场，广东 乐昌 512219；3.南宁市人民公

园，广西 南宁 530012；4.广州南沙明珠湾区开发有限公司，广东 广州 511455）

选取饱满有光泽的红皮糙果茶Camellia crapnelliana种子，进行种子贮存生活力测定、种子发芽试验及种皮解剖结构观察等研究，就种子繁殖探讨其濒危原因。结果表明，有利于保持种子生活力的贮存方式为：4 ℃贮存>常温贮存>-10 ℃贮存；种子发芽试验中，采用不同浓度赤霉素(GA3)、吲哚丁酸(IBA)和不同温度温水处理，种子发芽率均不高，最高为40%；不同因素对种子发芽的影响不同，种子发芽最佳处理为800 mg·L-1GA3浸泡6 h；种皮解剖结构观察到红皮糙果茶种皮坚硬，由栓化壁和骨状石细胞组成，内、外部石细胞垂直交错排列，这可能是造成种子萌发困难的机械阻碍原因。

红皮糙果茶；种子生活力；发芽试验；种皮结构

红皮糙果茶 Camellia cra pnelliana又名克氏茶、红皮油茶、红皮山茶和八瓣糙果茶，属山茶科Theaceae山茶属Camellia糙果茶组Sect. Furfuraceae植物。常绿小乔木，高可达10 m；树皮表面有铁锈色至砖红色粉状物，细枝无毛；叶厚革质，叶缘有细齿，叶脉明显；花白色，有麝香味，单生或簇生于枝顶或叶腋，花径4～10 cm；雄蕊约150枚，无毛；雌蕊花柱3条，基部离生，下部有毛，子房被绒毛；蒴果卵球形，长7.0～11.4 cm，直径7.8～12.0 cm，表面糠秕状粗糙，每果有种子6～18粒；花期秋季。

红皮糙果茶是在1903年由香港前林务监督在香港柏架山首次发现，并命名为“克氏茶”，现在福建、广东、广西南部、江西东部及浙江南部发现有分布[1]。目前，福建德化、永安、大田、古田、屏南、政和等县及香港九龙半岛马鞍山已引种栽培[2]。

红皮糙果茶花大芳香，树干颜色与叶片革质亮绿形成对比，且种子含油丰富，产油率达17%～35%，是很有价值的观赏植物和油料植物[3—4]。由于野生资源数量稀少，1992年被列入《中国植物红皮书》，为国家二级保护植物[5]，2004年被《中国物种红色名录》列为极危种[6]。目前对红皮糙果茶的研究仅在叶片光合特性、种子含油量和园林应用等方面有少量报道[7—10]。本文对红皮糙果茶种子生活力、发芽率及种皮解剖结构进行试验和观察，并由此探讨其濒危原因。

1　材料与方法

1.1材料

2012年10月于中山大学南校区竹园和华南植物园山茶专类园采收红皮糙果茶果实。将成熟果实置于室内通风处，使其自然开裂，收集种子。

1.2方法

1.2.1种子生活力测定选取饱满有光泽种子90粒，分成3份，每份30粒，装入自封袋中，分别贮存在冰箱保鲜层(BX0，4 ℃）、冰箱冰冻层(BD0，-10 ℃）及室内常温(CW，20～30 ℃)。

在三种环境下贮存1月后，每组取10粒种子，重复3次，将水煮5 min的种子作为对照组(CK)，采用红四氮唑(TTC)定量法测定种子活力。将待测种子浸泡至充分吸胀，除去种皮，剥出种胚。将样品放进具塞试管中，加入10 mL 0.1% TTC溶液，于38 ℃左右的恒温水浴中黑暗下染色2 h，自来水冲洗样品2～3次，滤纸吸干浮水，观察样品染色部位和程度。然后将样品全部倒入研钵，加少许石英及乙醇，充分研磨，将研磨液全部倒入容量瓶中，定容并摇匀。再将部分提取液倒入10 mL离心管中，于10 000 r·min-1离心5 min，吸出一定量的上清液供比色用。最后用分光光度计于490 nm处测定并比较光密度值，评价各样品种子生活力[11]。

1.2.2种子发芽试验基质为河沙，用0.2% KMnO4溶液消毒，覆膜2 d，揭开后用自来水冲洗3次，并晾晒1 d。沙床厚度为15 cm，覆盖石棉瓦进行保湿和遮荫。

用0.5% KMnO4溶液浸泡种子消毒15 min，自来水冲洗干净。用赤霉素(GA3)、吲哚丁酸(IBA)和温水处理，GA3和IBA的浓度梯度为400、800、1000mg·L-1，温水的温度梯度为30、50、70 ℃，处理时间梯度为6、12、24 h。对不同处理浓度、处理时间采用三因素三水平进行正交试验设计，试验中设清水对照组(表1)。每处理20粒种子，3次重复。30 d计算发芽势，45 d统计发芽率并测量根长和根粗。

表1　红皮糙果茶播种试验设计Table 1　Seed germination experiment of Camellia crapnelliana

1.2.3石蜡切片将种皮剪成1 cm ×1 cm的小块，用FAA固定液浸泡，固定24 h以上。在脱水之前，将固定的种皮置于烧杯中，用水反复煮沸，使其软化。常规石蜡切片法制片[12]，番红固绿对染，加拿大树胶封片。在光学显微镜下观察，用Motic Images Advanced 3.2软件测量和拍照。

2　结果与分析

2.1种子生活力

经0.1% TTC水浴染色2 h后，若种胚为红色则代表种子具有生命力，且颜色越深则生活力越大。统计每组种胚被染色情况，贮存于冰箱保鲜层的种子平均染红数为8.3粒，其中有2.3粒为浅红；贮存于冰箱冰冻层的种子平均染红数为1.3粒，其中1.0粒为浅红；贮存于常温的种子平均染红数为9.3粒，其中3.0粒为浅红；对照组的种子均死亡，没有染红。由表2可知，在染红数和深红数的数量指标上，冰箱冰冻层的种子生活力明显低于冰箱保鲜层和常温贮存的种子，且差异达显著水平，但冰箱保鲜层和常温的差异不显著。因此，冰箱冰冻层不宜贮存红皮糙果茶种子。

为进一步确定种子贮存的最佳条件，采用分光光度计于490 nm处测定光密度值。冰箱保鲜层的种子平均光密度值为0.061，冰箱冰冻层的平均光密度值为0.027，常温的平均光密度值为0.048，煮死的种子平均光密度值为0.025(表2)。保鲜层的种子平均光密度值显著高于其他处理，冰冻层与CK差异不显著，均低于常温贮存和保鲜层贮存的种子。光密度值高，表明种子生活力强，光密度值测定结果与种胚染色反映的种子生活力情况相符，进一步表明冰箱保鲜层的种子生活力高于其他处理。

表2　不同贮存环境下种子TTC染色情况和测定光密度值Table 2　Situation and optical density value of seeds after TTC test in different store environments

红皮糙果茶种子为油脂类种子，水分缺失是威胁种子生活力的主要因素之一。如图1所示，在两种贮存条件下，种子初期失水速率均较慢，至贮存7 d后急剧下降，失水明显，因而种子采收后应在一周内进行播种，超过一周后种子的失水会明显增加。存于冰箱保鲜层的种子总体失水率明显低于常温下的种子，因此贮存于冰箱保鲜层内的种子生活力优于常温下的种子。综上所述，红皮糙果茶种子贮存的最佳方式为冰箱保鲜层(4 ℃)贮存，其次为常温贮存，冰箱冰冻层最差。

图1　红皮糙果茶种子的失水率Fig. 1　Loss water ratio of Camellia crapnelliana seeds

2.2种子发芽正交试验

由表3可见，经50 ℃温水处理6 h的种子发芽率最高，为40%；其次为400 mg·L-1GA3处理6 h和800 mg·L-1IBA处理24 h，发芽率均为36.67%，均高于对照组。而800 mg·L-1GA3处理12 h和70 ℃温水处理12 h的种子发芽率均为0，70 ℃温水处理12 h种子可能因为水温偏高而失去生活力。从发芽势来看，400 mg·L-1GA3处理6 h的种子在第20 d开始萌动，萌芽最早，且发芽最整齐，平均根长最长，达7.03 cm；其次为50 ℃温水处理6 h的种子，发芽势为26.67%；但平均根粗则以400、800 mg·L-1IBA分别处理12、24 h的种子较好。

极差分析表明，影响种子发芽率的主次因素依次为C > B > A，即处理时间对发芽率影响最大，为最主要因素，最优方案为A1B2C1，即800 mg·L-1GA3处理6 h；影响种子发芽势的主次因素为C > A > B，即处理时间对发芽率影响最大，为最主要因素，最优方案为A1B2C1，与发芽率的最优方案相同；影响种子发芽平均根长的主次因素为C > B > A，即处理时间为主要因素，最优方案为A1B1C3，即400 mg·L-1GA3处理24 h；影响种子平均根粗的主次因素为C > A > B，即处理时间为主要因素，其次为试剂，最优方案为A2B1C3，即400 mg·L-1IBA处理24 h(表3)。此外，从B × C交互列的极差可以看出，浓度和时间的交互作用对各个指标都有重要的影响，因此后续试验中应注意浓度和时间的合理搭配。

表3　红皮糙果茶种子发芽正交试验Table 3　Results of seed germination test of Camellia crapnelliana

通过综合平衡法分析，对于前三个指标来说，因素A均以A1为最佳水平，对于平均根粗则以A2为佳，但对于根粗A为较次要因素，因此因素A选取A1水平。就因素B而言，发芽率和发芽势两个指标以取B2为佳，对于平均根长和平均根粗则取B1较好，对于四个指标，B为较次要的因素，而且指标中以发芽率最为重要，故选取B2水平。C因素是影响四个指标最主要的因素，在确定最优水平时应重点考虑，其中，对于发芽率和发芽势两个指标来说，以C1最佳，而对于另两个指标，C1和C3相差不大，故根据指标的重要程度，取C1水平。因此，正交试验设计得到综合的最优方案为A1B2C1，即800 mg·L-1GA3处理6 h。

2.3不同因素对红皮糙果茶种子胚根生长的影响

方差分析表明，影响红皮糙果茶种子发芽平均根长的主要因素有浓度(B)、时间(C)及两者的交互作用(B × C)，且均达极显著水平(P<0.01)，试剂因素(A)则达显著水平(P<0.05)，表明浓度和时间对红皮糙果茶种子发芽后的根长生长具有更重要的影响(表4)。

表4　红皮糙果茶种子根长方差分析Table 4　Analysis of variance on average root length of Camellia crapnelliana seed germination

不同因素对平均根长的多重比较显示，浓度为400 mg·L-1最利于根长生长，与其他两个浓度之间达显著差异；从时间因素分析，以6 h和24 h最利于根长生长；从试剂因素分析，GA3更有利于根长生长，与温水处理达显著差异(表5)。

表5　不同因素对平均根长影响的多重比较Table 5　Multiple comparison analysis on effect of different factors on average root length

从表6可见，试剂、浓度、时间及浓度和时间交互作用对红皮糙果茶种子根粗的影响均达到极显著水平，其作用顺序为：时间 > 浓度和时间交互作用 > 浓度 > 试剂。

表6　红皮糙果茶种子根粗方差分析Table 6　Analysis of variance on average root diameter of Camellia crapnelliana seeds

不同因素对平均根粗的多重比较显示，浓度为400 mg·L-1最利于根的增粗，与其他两个浓度之间达显著差异；从时间因素分析，三个水平之间均达显著差异，以处理24 h对发芽后根粗生长效果最佳；从试剂因素分析，IBA更有利于根的增粗，与GA3和温水处理达显著差异(表7)。

表7　不同因素对根粗影响的多重比较Table 7　Multiple comparison analysis on effect of different factors on average root diameter

综上分析，GA3对促进种子萌发和胚根的伸长具有明显作用，IBA对胚根的增粗生长具有明显的促进作用；在试剂浓度使用上，以高浓度短时间处理对种子的发芽具有明显促进作用，而低浓度长时间处理对种子的后期发育有明显促进作用；试剂的处理时间对红皮糙果茶的种子发芽率和发芽势影响最大，时间太短效果没达到最佳，时间太长对发芽起到抑制作用。

2.4种皮结构

红皮糙果茶的种皮较坚硬，由栓化壁和石细胞组成(图2: A)。栓化壁厚度为23.94 µm；石细胞层数较多，根据石细胞的排列形态，可将其分为外部石细胞和内部石细胞两部分(图2: B, C)。两部分石细胞均为骨状石细胞，具单纹孔。外部石细胞厚度为604.77 µm，内部石细胞厚度为829.17 µm，两者呈垂直交错排列。栓化壁和排列紧密的石细胞可能是造成种胚萌发的机械障碍。

图2　红皮糙果茶的种皮结构Fig. 2　Testa structure of Camellia crapnelliana seedA.种皮结构; B.种皮外部石细胞; C.种皮内部石细胞

3　讨论

3.1贮存方式对种子生活力的影响

Roberts[13]根据种子的贮藏特性将其分成两大类，即正常型种子和顽拗型种子，顽拗型种子成熟脱落时含水量较高，轻度脱水后生活力显著下降。山茶属多数种类的种子属于顽拗型种子[14]，常用的贮存方法有：用箩筐等盛装种子，储存于 20 ℃以下干燥通风的室内，一般在冬季可储存50～60 d；沙藏于干燥通风良好的室内，可储存120 d左右；用编织袋和麻袋等盛装种子，储存于5～6 ℃干燥通风的低温冷库中，可储存1年左右[15]。

将红皮糙果茶种子置于常温、冰箱保鲜层和冰箱冷冻层三种环境下，结果表明，贮存于保鲜层的种子生活力最高，与冰冻层种子生活力差异显著。置于冰箱冰冻层的种子生活力接近于开水煮死的种子，与顽拗型种子对低温非常敏感的观点是一致的[13]。

山茶属植物种子的短期保存方法较多，但不能保证种子播种后有较高的发芽率，生产中常将油茶种子带果壳贮存，可以保存 7～10月，且能提高发芽率。近年来，人们对油茶种子种质的超低温保存进行了探索性研究，以期能够长期保存种质。本研究表明，红皮糙果茶种子短期贮存的最佳方式为存放于冰箱保鲜层(4 ℃)，但后期的发芽情况有待进一步研究。

3.2不同因素对种子发芽的影响

GA3较IBA对促进种子萌发和胚根伸长的作用更加明显，与杨成利等[16]报道的用GA3处理耐冬山茶Camellia japonica种子发芽效果一致，IBA则主要表现在促进胚根的增粗。从温度因素分析，水温越高，软化种皮和解除休眠效果越好，50 ℃时发芽率最高，但种子不能耐受过高温度，70 ℃时被致死，与袁军等[17]报道的油茶Camellia oleifera种子发芽效果一致。浓度和时间对种子发芽的交互作用明显，高浓度试剂短时间处理对种子发芽具有明显的促进作用，而低浓度长时间处理对种子的后期发育有明显的促进作用，高浓度长时间处理则对种子发芽起到抑制作用。

3.3造成物种濒危状态的原因

3.3.1生活力对萌发的影响种子生活力是指种子能够萌发的潜在能力或种胚具有的生命力。红皮糙果茶种子在20～30 ℃和4 ℃环境下短期贮存后生活力水平较高，种子仍具有萌发潜在能力。然而，野生环境下种子成熟后会从植株脱落下来，含油量高的种子会吸引昆虫啃食；种子若长期不萌发，所含油分会导致种子酸败而失去生活力；随着贮存温度的降低，种子的生活力也逐渐地减弱，在-10 ℃环境下短期贮存的种子几乎失去生活力，不能萌发。虽然红皮糙果茶的种子数量多，但野生环境下种子受到昆虫威胁，且遇到低温会丧失生活力，种子无法及时繁衍，易造成物种濒危。

3.3.2种皮结构对萌发的影响种皮一方面对种子种胚起保护作用，但同时也成为阻碍种子萌发的主要因素。Wolfgang[18]研究认为，种皮对种子萌发的阻碍作用可能是由于种皮结构的物理特性造成，导致种子对外界水分、气体等成分通透性的改变。红皮糙果茶种皮具有许多穿孔，没有完全阻隔种胚与外界进行物质交换，但石细胞层数多，排列紧密。因此，从结构上来看，种皮一方面木质化严重，阻碍种子萌发；另一方面，因穿孔形成良好的种皮通透性致使子叶和胚易失水而失活。红皮糙果茶种子发芽率不高，除了种皮机械阻碍因素外，种子内是否含有萌发抑制物有待进一步验证。

[1] Min T L, Bruce B. Theaceae[M]/ Wu Z Y, Raven P H. Flora of China(Vol. 12). Beijing: Science Press, 2007: 365.

[2] 中国科学院植物研究所. 中国珍稀濒危植物[M]. 上海: 上海教育出版社, 1989: 332—334.

[3] 罗仲春,罗毅波. 城镇绿化树种引种指南[M]. 北京: 中国林业出版社, 2006: 194—196.

[4] 陈巧女. 金花茶等3种茶科树种种苗形态特征及引种栽培研究[J]. 江西林业科技, 2007(3): 13—16.

[5] 傅立国. 中国植物红皮书-珍稀濒危植物[M]. 北京: 科学出版社, 1992: 656.

[6] 崔勇,门媛媛,陈海红,陆有通,毛钟警. 红皮糙果茶的园林应用初探[J]. 北方园艺, 2011(19): 94—96.

[7] 魏琦. 红皮糙果茶扦插试验[J]. 中国园艺文摘, 2014(1): 37—38.

[8] 李庭海,李乐兴,刘晓,黎科,张永夏. 油料植物红皮糙果茶与油茶叶片光合特性研究[J]. 安徽农业大学学报, 2014,41(6): 146—149.

[9]荣,陈北光. 广东山茶科稀有濒危植物的区系特点和保护评价[J]. 华南农业大学学报, 2000,21(2): 34—37.

[10] 崔勇,门媛媛,陈海红,陆有通,毛钟警,梁日凡,刘永华. 我国山茶属糙果茶组植物资源及其园林应用探析[J]. 安徽农业科学, 2011,39(23): 14 329—14 330, 14 333.

[11]胡晋. 种子生物学[M]. 北京: 高等教育出版社, 2006: 201, 299.

[12] 李正理. 植物制片技术[M]. 北京：科学出版社, 1987: 129—135.

[13] Roberts E H. Predicting the storage life of seeds[J]. Seed Science and Technology, 1973(1): 499—514.

[14] Famsworth E A. The ecology and physiology of viviparous and recalcitrant seeds[J]. Annual Review of Ecology and Systematics, 2000,31(1): 107—138.

[15] 敖礼林. 油茶果实的采收和茶籽的储存技术[J]. 科学种养, 2010(10): 55.

[16] 杨成利,史效玉,马春花, 殷秋燕,王福民. 耐冬山茶种子萌发特性研究[J]. 山东林业科技, 2011(4): 63—66.

[17] 袁军,谭晓风,罗健,李卫星. 不同处理措施对普通油茶种子萌发的影响[J]. 中国种业, 2009(9): 50—51.

[18] Wolfgang S. Dormancy characteristics and germination timing in two alpine garex species[J]. Basic and Applied Ecology, 2002,3(2):125—134.

Seed Viability and Germination Test on Camellia crapnelliana

LI Wei1, LIANG Qin2, ZHANG Chao1, SU Dan-ping1,3, HE Tao1,4, CUI Da-fang1
(1.College of Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong China;
2.Lechang Forest Farm of Guangdong Province, Lechang 512219, Guangdong China; 3.Nanning People’s Park, Nanning
530012, Guangxi China; 4.Guangzhou Nansha Pearl Bay Development Co. Ltd., Guangzhou 511455, Guangdong China )

The wild resource of Camellia crapnelliana had been badly damaged and it was listed as critically endangered species, growing only in a narrow geographical range. To explore its endangered causes, seed propagation mode was carried out. Used plump and shiny C. crapnelliana seeds as material, seed storage viability, seed germination and seed anatomical characteristics observation were determined. The results showed that the highest seed viability for seeds of C. crapnelliana was stored in refrigerator layer (4 ℃), and the worst was stored in freezer frozen layer (-10 ℃). In seed germination test, seed germination rate was not high (≤40%), and the influence of different factors was different, the optimum treatment to improve seed germination rate was 6-hour immersion in 800 mg·L-1GA3. The testa of C. crappnelliana was hard, consisting of suberized wall and sclereid, which may be the mechanical barrier for embryo germination.

Camellia crapnelliana; seed viability; seed germination test; testa structure

10.3969/j.issn.1009-7791.2015.02.003

Q945.34

A

1009-7791(2015)02-0101-06

2015-04-02

广东省林业科技创新专项(2011KJCX003)；广东省科技计划项目(2013B060400019)

李薇，硕士，从事生物技术与园林植物资源研究。E-mail: liwei6237362@126.com

注：崔大方为通讯作者。E-mail: cuidf@scau.edu.cn