21个日本牡丹品种DNA指纹图谱构建与EST—SSR标记遗传多样性分析

孙嘉磊等

摘要：采用EST-SSR标记构建中国常熟尚湖牡丹园引栽的21个日本牡丹品种DNA指纹图谱并进行遗传多样性分析。以筛选出的10对多态性高、稳定性好且在染色体上分布均匀的引物作为核心引物，构建日本牡丹21个品种DNA指纹图谱，用NTSYS-PCV2.10软件分析遗传多样性。结果表明，10对EST-SSR引物在21份材料中共扩增出47个多态性基因型，平均每对引物扩增4.7个，变幅1～11个；10对引物的多态性频率（FP）平均值为0.522，变幅0227～0.950；筛选出的2对核心引物可以将21个牡丹品种完全区分，以遗传相似系数0.55为阈值可将21个供试牡丹品种分成2类。由结果可知，EST-SSR标记在供试牡丹品种间多态性差异较大，适合用于牡丹的DNA指纹图谱的构建。

关键词：EST-SSR；DNA指纹图谱；遗传多样性；牡丹品种

中图分类号： S685.11文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0050-04

收稿日期：2014-09-21

基金项目：江苏农业科技支撑计划（编号：BE2011445）；江苏省大学生实践创新训练计划（编号：201310333032Y）；江苏省苏州市科技计划（编号：SZS201102、SYN201110、SNG201323）；苏州市吴江区科技计划（编号：WN201311、WN201317）；江苏省常熟市科技计划（编号：CS201205）。

作者简介：孙嘉磊（1992—），男，江苏太仓人，研究方向为植物资源利用开发。

通信作者：杨志刚，硕士，副教授，从事天然产物研究与开发。Tel：（0512）52251562；E-mail：zhigangyang77@sina.cn。牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews.）花大色艳，花香袭人，有“国色天香”之美誉，深受人们喜爱。关于DNA指纹技术在牡丹品种鉴别上的应用，前人做了很多研究。朱红霞利用AFLP标记对牡丹品种的分类进行了初步探索[1]。Hosoki等利用RAPD标记技术对牡丹品种和野生牡丹品种的DNA序列进行了尝试性分析[2]。由于技术比较成熟，以微卫星序列为基础的SSR标记成为当前植物品种DNA指纹图谱数据库的首选标记[3]。李保印利用SSR标记技术研究中原牡丹品种初级核心种质和遗传多样性，并建立了核心种质[4]。王淼等研究讨论了牡丹品种的SSR-PCR反应条件[5]。SSR分子标记技术可以用来区分牡丹品种，这是不容争辩的事实[6]，近年来EST（expressed sequence tages）发展十分迅速，而EST-SSR与其他鉴别途径相比，是一种相对准确、简便、经济的途径[7]。Temnykh 等研究显示，他们所发现的牡丹EST-SSR位点绝大多数都具有多态性潜能[8]。张艳丽等以6个滇牡丹不同花色类群DNA为模板，对EST-SSR引物进行了筛选[9]。

牡丹品种的起源地在中国，在中国牡丹园艺栽培不断发展的同时，日本也早就开始进行牡丹园艺品种的杂交培育和引种工作，形成了具有地方特色的牡丹品种群[10]，而目前针对国内引栽的日本品系牡丹开展DNA指纹图谱构建及遗传多样性的研究还未见报道。本研究采用EST-SSR标记构建中国常熟尚湖牡丹园21份日本品系牡丹品种的DNA指纹图谱并进行遗传多样性分析，以期为牡丹品种DNA指纹鉴定提供技术支持。

1材料与方法

1.1供试材料

21份牡丹品种为中国常熟尚湖牡丹园引栽的日本牡丹品种，详见表1。

表1供试21份日本牡丹主栽品种概况

编号品种名称花色编号品种名称花色1岛锦复色12岛大臣紫2岛辉红13金晃黄3日暮红14海黄黄4百花选红15玉廉白5火鸟红16连鹤白6花王深银红17黑龙锦墨紫7芳纪火红18新扶桑白8新日月红19八千代椿银红9红辉狮子大红20吉野川粉10花竞粉21紫晃粉11皇嘉门黑紫

1.2DNA提取

按照CTAB法提取牡丹基因组DNA，操作流程如下：（1）在研钵中加入100 mg牡丹叶片样品和700 μL CTAB提取液，充分研磨；（2）转移混合液至1.5 mL离心管中，65 ℃水浴 30 min，每隔5 min振荡混匀；（3）取出离心管，冷却到室温后，于8 000 r/min离心2 min；（4）取出离心管，将上清液转移至1.5 mL离心管中，加入等体积三氯甲烷混匀，振荡10 min；（5）12 000 r/min常温离心10 min；（6）转移上清液至1.5 mL离心管中，加等体积异丙醇，混匀后静置10 min，于 12 000 r/min 离心10 min，弃上清液，用70%～75%乙醇漂洗沉淀2次，在超净工作台上吹干；（7）加50 μL ddH2O，将沉淀DNA溶解后于4 ℃冰箱保存备用。

1.3引物信息

以张艳丽等对滇牡丹不同花色类群开发的10对EST-SSR引物[9]作为本研究的候选引物（表2），引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化。

20 μL反应液中包括10×PCR buffer、0.1 mmol/L dNTP、1 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol/L Mg2+、50 ng DNA模版和 03 μmol/L EST-SSR引物。反应程序：94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物选用60 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，36 W电泳3 h。参考王凤格等的快速银染法[11]并稍加修改：50%乙醇、2.5%冰乙酸组成的固定液固定5 min；双蒸水快速漂洗1次；0.2%AgNO3染色5 min；15% NaOH、0.4%甲醛组成的显影液显影；固定液定影。