RP-HPLC法同时测定狭基线纹香茶菜中4个碳苷黄酮

唐海明，　陈建南，2，　黎 爱，　罗宇欣，　赖小平，2，　黄 松，2*

（1.广州中医药大学新药开发研究中心，广东　广州　510006；2.东莞广州中医药大学中医药数理工程研究院，广东　东莞　523808）

RP-HPLC法同时测定狭基线纹香茶菜中4个碳苷黄酮

唐海明1，陈建南1，2，黎 爱1，罗宇欣1，赖小平1，2，黄 松1，2*

（1.广州中医药大学新药开发研究中心，广东广州510006；2.东莞广州中医药大学中医药数理工程研究院，广东东莞523808）

目的 建立同时定量测定狭基线纹香茶菜中viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin的RH-HPLC。方法

RH-HPLC；狭基线纹香茶菜；viceninⅡ；isoschaftoside；schaftoside；vitexin

狭基线纹香茶菜为唇形科香茶菜植物，是广东地区中药溪黄草的主流产品之一，具有清热利湿及退黄功效，用于湿热黄疸、湿热泻痢、急性黄疸型肝炎、急性胆囊炎而有黄疸者［1］。

狭基线纹香茶菜主要含有挥发油、萜类、酚酸、黄酮类和香豆素等成分。药理研究表明，狭基线纹香茶菜水提物具有抗炎、保肝作用［2］。前期实验成功从狭基线纹香茶菜水提物中分离得到viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin等黄酮碳苷类成分。研究表明，黄酮碳苷具有保肝、护肝的功效［3］，其中viceninⅡ具有抗炎、抗氧化、抗CC14和半乳糖肝损伤作用［4］及抗前列腺癌作用［5］，isoschaftoside［6］和vitexin［7］具有保肝、护肝的功效。

目前，有关狭基线纹香茶菜质量控制方面研究有咖啡酸、迷迭香酸、二萜类、三萜类和挥发油成分定量测定的报道［8-11］，而笔者在研究狭基线纹香茶菜水溶性成分时发现，狭基线纹香茶菜水提物中含有较多黄酮碳苷类成分，黄酮碳苷类成分有较强的生物活性，尚未有HPLC法同时测定狭基线纹香茶菜中多种黄酮碳苷的报道，加之国内外对狭基线纹香茶菜水溶性成分报道同样少，这些研究不能全面系统地评价狭基线纹香茶菜的质量，使得其质量监控标准缺乏。本研究建立了HPLC法同时定量测定狭基线纹香茶菜中viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin的方法。

1　仪器与试药

日本岛津高效液相色谱仪（SIL-20A自动进样器，LC-20AT紫外检测器，DGU-20A5柱温箱）；万分之一电子天平（Sartorius BP110 s，德国赛多利斯公司）；粉碎机械FZ-230型（温岭市牧屿百乐机床厂）；超声清洗器（ULTRASONIC，360 kW，250 kHz）。

流动相所用甲醇为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。

对照品viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin均自制，经ESI-MS，1H-NMR和13C-NMR确认，纯度＞98%，各化合物结构见图1。

图1　4个碳苷黄酮的结构Fig.1　Structures of four C-gIycosyI fIavones

狭基线纹香茶菜，采自不同产地，经广州中医药大学新药开发研究中心陈建南研究员鉴定为唇形科香茶菜属植物狭基线纹香茶菜Isodon lophanthoides var.gerardianus（Benth.）H.Hara，以上凭证标本存于广州中医药大学新药开发研究中心。

2　方法与结果

2.1混合对照品溶液 精密称取上述各对照品适量，以甲醇制成含viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin质量浓度分别为380、660、430、480μg/mL的混合溶液，即得。

2.2供试品溶液 药材经粉碎机粉碎，过40目筛。取样品粉末约0.5 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，加70%乙醇25 mL，称定质量，超声提取30 min，取出待冷却后再次称定质量，用70%乙醇补足减失质量，取续滤液过0.45μm滤膜，即得。

2.3色谱条件及系统适用性考察 采用日本岛津LC-20AT，C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱（0～5 min，16%～25%甲醇；5～20 min，25%～30甲醇；20～40 min，30%甲醇；40～65 min，30%～45%甲醇），体积流量0.8 mL/min，柱温为25℃，检测波长334 nm，进样量15μL。各峰与相邻峰的分离度均大于1.5，理论塔板数均在10 000以上。样品与对照品的色谱图见图2。

图2　对照品（A）与1号样品（B）的HPLC图Fig.2　HPLC chromatogram s of reference substances（A）and sam p Ie No.1（B）

2.4线性关系考察 取“2.1”项下混合对照品溶液，分别取1、3、5、7、9、11μL，注入液相色谱仪，重复进样测定3次，记录色谱峰。以进样量Ⅹ（μg）为横坐标，峰面积平均值Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，4个碳苷黄酮对照品线性关系良好，回归方程、线性范围、相关系数见表1。

2.5精密度试验 精密吸取同一供试品（样品1，广东饶平基地）溶液，连续进样6次，测定峰面积。结果viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin峰面积的RSD（n=6）分别为0.9%、0.6%、0.9%、0.6%，表明仪器精密度良好。

表1　4个碳苷黄酮的线性关系（n=6）Tab.1 Linear reIationship of four C-gIycosy I fIavones（n=6）

2.6重复性试验 分别称取同一批样品（样品1，广东饶平基地）6份，按“2.2”项下方法平行制备6份试品溶液，进样15μL，记录viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin的峰面积值，代入“2.4”项下回归方程，计算。结果样品中viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin的平均含有量分别为8.09、11.86、4.82、2.27 mg/g，RSD依次为1.3%、2.0%、0.9%和0.9%，表明该方法重复性良好。

2.7稳定性试验 取同一份供试品（样品1，广东饶平基地）溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样15μL，记录色谱图，计算viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin色谱峰的峰面积值，计算其RSD分别为1.0%、1.2%、1.1%、1.7%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8加样回收率试验 取“2.6”项中已测知含有量的狭基线纹香茶菜粉未6份，每份约0.5 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入每1mL含viceninⅡ1 080μg、isoschaftoside 1 735μg、schaftoside 1 186μg、vitexin 1 349μg的混合对照品溶液1.0 mL，氮气吹干，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样15μL，计算viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin的量，并根据加入量计算回收率，结果见表2，表明方法准确度良好。

表2　加样回收率试验结果（n=6）Tab.2 Resu Its of recovery tests（n=6）

2.9样品测定 取狭基线纹香茶菜样品，分别按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，精密取供试品溶液15μL进样分析，以外标法计算各成分，结果见表3。

表3　16批狭基线纹香茶菜药材中4个碳苷黄酮的测定结果（mg/g，n=3）Tab.3 Contents of four C-gIycosy I fIavones in Isodon Lophanthoides from different origins（mg/g，n=3）

3　讨论

分别对viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside和vitexin溶液进行了紫外全波长扫描，其最大吸收波长均在334 nm左右，在该波长下测定样品，各成分峰形较好，基线稳定，干扰少，故选择334 nm作为检测波长。

本实验对4种常用的流动相系统（乙腈-水、乙腈-磷酸水、甲醇-水、甲醇-磷酸水）的应用进行了考察，结果表明上述系统在等度洗脱情况下，所测的viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside和vitexin 4个成分达不到很好的分离效果，用乙腈作有机相时，同分异构体isoschaftoside和schaftoside根本不能分离开，最终用甲醇-0.1%磷酸系统，被测4个黄酮碳苷类成分分离度良好，峰形窄而对称，不受其他峰的干扰。

本实验所测viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside和vitexin为极性较大的黄酮碳苷类成分，试样对提取溶剂10%、30%、50%、70%、80%、95%乙醇等进行了选择，结果用70%乙醇作提取溶剂，提取率高，其他成分干扰小。有关各组分提取工艺的优化有待进一步研究。有关各成分含有量、采收时间之间的关系以及溪黄草各品种之间成分含有量的差异，将在后期实验中进一步研究。本实验建立的方法简便、快速、准确，可用于狭基线纹香茶菜viceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside和vitexin含量的测定，对于狭基线纹香茶菜（溪黄草）的质量控制、质量标准的建立均具有重要意义。

［1］吴剑峰.溪黄草的研究综述［J］.时珍国医国药，2003，14（8）：498-499.

［2］廖雪珍，廖惠芳，叶木荣，等.线纹香茶菜、狭基线纹香茶菜、溪黄草水提物抗炎、保肝作用初步研究［J］.中药材，1996，19（7）：363-365.

［3］龚金炎，吴晓琴，张 英，等.碳苷黄酮及其药理活性研究进展［J］.天然产物研究与开发，2010，22（3）：525-530.

［4］Car1a M，Roberto D，Cristina A，et all.Vicenin-2，a potentia1 anti-inf1ammatory constituent of Urtica circularis［J］.J Nat Prod，2011，74（6）：1503-1507.

［5］Lokesh D N，Rit V，Jyotsana S，et al.Anti-cancer effects of nove1 f1avonoid vicenin-2 as a sing1e agent and in synergistic combination with docetaxe1 in prostate cancer［J］.Biochem Pharm，2011，82（9）：1100-1109.

［6］Wada S，He P，Watanabe N，et al.Suppression of D-ga1actosamine-induced rat 1iver injury by g1ycosidic f1avonoids-rich fraction from green tea［J］.Biosci Biotechnol Biochem，1999，63（3）：570-572.

［7］惠永正.中药天然产物大全［M］.上海：上海科学技术出版社，2011：2688-2689.

［8］吴剑峰，刘 斌，祝晨蔯，等.不同种植基地的溪黄草茎、叶及全草中2α-羟基熊果酸的含量测定［J］.中国药学杂志，2004，39（7）：500-501.

［9］朱德全，黄 松，陈建南，等.不同品种、不同产地溪黄草咖啡酸与迷迭香酸的含量测定［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（2）：114-116.

［10］匡艳辉，梁 斯，姚小华，等.HPLC法测定纤花线纹香茶菜中异夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸［J］.中成药，2013，35（3）：570-573.

［11］叶其馨，蒋东旭，熊艺花，等.GC-MS测定溪黄草、狭基线纹香茶菜及线纹香茶菜挥发油的化学成分［J］.中成药，2006，28（10）：1482-1484.

Simu Itaneous determ ination of four C-gIycosyI fIavones from Isodon Lophanthoides by RP-HPLC

TANG Hai-ming1， CHEN Jian-nan1，2， LIAi1， LUO Yu-xin1， LAIXiao-ping1，2， HUANG Song1，2*
（1.New Drug Research&Development Center，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China；2.Dongguan Institution for Mathematics and Theoretics Engineering Research，Guangzhou University of Chinese Medicine，Dongguan 523808，China）

AIM To estab1ish an RP-HPLCmethod for simu1taneous1y determining the contents of viceninⅡ，isoschaftoside，schaftoside and vitexin from Isodon Lophanthoides.METHODS The ana1ysis of ethano1ic extrctof I.Lophanthoides was performed on Phenomenex 1una C18（250mm×4.6mm，5μm）co1umn and amobi1e phase consisting ofmethano1and 0.1%phosphoric acid in a gradient e1ution mode，f1ow ve1ocity was 0.8 mL/min and the detection wave1ength was setat344 nm，with the co1umn temperature of25℃.RESULTS The 1inear ranges of viceninⅡ，isoschaftoside，schaftoside，vitexin were 0.38-4.18μg，0.66-7.26μg，0.43-4.73μg，and 0.48-5.28μg，respective1y.Their average recoveries（n=6）were 97.7%（RSD=1.6%），98.8%（RSD= 2.1%），96.9%（RSD=1.8%），and 100.1%（RSD=1.9%），respective1y.CONCLUSION The method is themost suitab1e for quantitative determination of C-g1ycosy1 f1avones from I.Lophanthoides，especia11y in the se-1ection of wave1ength，mobi1e phase，and extract so1ution.

RP-HPLC；Isodon Lophanthoides；viceninⅡ；isoschaftoside；schaftoside；vitexin

R284.1

A

1001-1528（2015）01-0138-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.028

2014-03-11

国家科技支撑计划项目（2012BAI29B00）

唐海明（1988—），男，硕士生，主要从事中药新药筛选与研究。Te1：15088068915，E-mai1：thm1835@qq.com

黄 松（1973—），男，研究员，主要从事中药新药开发。Te1：13668987309，E-mai：huangnn421@163.com

狭基线纹香茶菜70%乙醇提取液分析采用Phenomenex 1una C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱，体积流量0.8 mL/min，检测波长344 nm；柱温为室温（25℃）。结果 ViceninⅡ、isoschaftoside、schaftoside、vitexin线性范围分别为0.38～4.18μg、0.66～7.26μg、0.43～4.73μg、0.48～5.28μg；平均回收率（n=6）分别为97.7%、98.8%、96.9%、100.1%，RSD分别为1.6%、2.1%、1.8%、1.9%。结论 本法的检测波长，流动相和提取溶剂的选择在狭基线纹香茶菜中黄酮碳苷类成分的定量分析上是最适合的。