羟乙基淀粉沉降法制备外周血富白细胞血浆的条件优化

史艳利 高岭 张宪伟 李萌 陈红兵

羟乙基淀粉沉降法制备外周血富白细胞血浆的条件优化

史艳利 高岭 张宪伟 李萌 陈红兵

目的 探讨羟乙基淀粉（HES）沉降法制备外周血富白细胞血浆的最佳分离条件。方法 观察外周血与 6 %的羟乙基淀粉混匀后静止30 min、60 min及离心等不同处理后，计算其回收率。结果 6 %HES与外周血体积比为 1∶4时，白细胞回收率较高，比例增大至l∶1 及4∶1，回收率降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。6% HES与外周血体积比为1∶4、1∶1及4∶1时血小板的回收率差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 建立制备外周血富白细胞血浆的优化条件：6 %的HES沉淀外周血 60 min，HES与外周血的比例1∶4时，外周血白细胞及血小板的回收率最高。

羟乙基淀粉 富白细胞血浆 富血小板血浆

羟乙基淀粉（HES）可与红细胞膜上的负电荷结合，使红细胞凹面相贴而使得沉降速度加快，以HES为沉降剂可将红细胞沉降分离去除。HES为沉降法目前在脐血分离中被广泛采用［1］。实际临床工作中，部分检测项目要求外周血富白细胞及富血小板血浆，而短时间的高速离心常使白细胞下沉，本文探讨HES沉降法制备外周血富白细胞血浆的最佳分离条件，现报道如下。

1　临床资料

1.1外周血来源 外周血采集自本科室健康工作人员，肝素抗凝。6%HES为中国大冢制药有限公司生产，主要化学成分为130/0.4，为氯化钠复方制剂。

1.2沉降实验 将6 % HES溶液与外周肝素抗凝血按一定体积比混匀，置于 5 m1肝素抗凝管自然静置沉降，室温静置30min、60min及沉降60min后低速离心等不同操作后，比较白细胞及血小板的回收率。回收率的计算公式为：Recovery=Vu·Cu/（Vu·Cu + Vd·Cd）=（Vu/ Vs）·（Cu/Cs）。下层（Ld）主要为红细胞团，包含少量白细胞，大部分白细胞集中在上层（Lu）段，取Lu段液体，计白细胞和总细胞数，Ld段的液体同样作计数，并由此计算白细胞回收率。

1.3细胞计数 白细胞计数：用白细胞稀释液进行稀释（冰醋酸2ml，蒸馏水98 ml，10 g/L亚甲蓝溶液3滴），混匀后过滤备用。血小板计数：用 10 g/L的草酸钠溶液稀释后，血细胞计数板进行计数。

2　结果

2.16 %HES溶液与全血不同体积比对白细胞回收率的影响 6 %HES与外周血体积比为1∶4时，白细胞回收率较高，比例增大到1∶1及 4∶1时，回收率降低。6 %HES与外周血体积比为 1∶4 时，沉淀60 min时，白细胞回收率最高，沉淀30 min时白细胞回收率次之，与沉淀60min比较，差异无统计学意义，P＞0.05。见表1。

表l HEs与外周血体积比、沉降间、沉降后离心白细胞回收率（%）

2.26%HEs溶液与全血体积比对血小板回收率的影响 相同处理条件下，6%HEs与外周血体积比为1∶4、1∶1及4∶1时PLT的计数差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2　HEs与外周血体积比、沉降时间、沉降后离心的血小板回收率（%）

2.36 %HEs与外周肝素抗凝血1∶4混匀对白细胞及血小板回收率的影响 选取30份标本，6 %HEs与外周肝素抗凝血1∶4混匀，白细胞及血小板回收率标本直接离心2800r/min离心2min后明显低于其余各组，差异有统计学意义，P＜0.05。沉降60min白细胞的回收率高于其他各组，有显著性差异（P＜0.05）。见表3。

表3　6%HEs与外周肝素抗凝血1∶4混匀，白细胞及血小板回收率（n=30）

2.4综合上述结果以及各表结果，羟乙基淀粉沉降法制备外周血富白细胞血浆时，6 %HES与外周血体积比为1∶4时，且沉降时间为60min白细胞回收率较高。

3　讨论

HES沉降法［2］在脐血分离中被广泛应用，本文探讨6%HES沉降法制备外周血富白细胞及富血小板血浆的条件优化，6%HEs为中分子羟乙基淀粉聚糖复合物［3，4］。HES沉降法外周血沉降过程是利用红细胞团和白细胞的沉降速度的差异来实现分离。红细胞团快速沉降而导致其周围液体的向上运动，带动了白细胞的向上运动，产生了对流现象［5，6］。本资料中HES溶液与全血体积比增大到1∶1及 4∶1 时，白细胞回收率降低，差异有统计学意义。6%HES与外周血体积比为1∶4，1∶4及4∶1时血小板的计数无差异。6 %HES与外周血体积比为1∶4时，且沉降时间为60min白细胞回收率较高，与郭继强［7］报道结果一致。

临床上短时间低速离心外周血常可以通过吸取中下层血浆来获取富血小板血浆，而部分检测指标在白细胞表面分布更广，这就需要分离出富白细胞及富血小板血浆，通过本方法为临床上需要用外周血中白细胞进行检测的指标提供一个简单优化的方法。

1 王颖超，殷楚云，冯磊，等.三种不同的方法分离脐血造血干细胞的效果比较 .实用儿科临床杂志，2012，27（10）：766～768.

2 马艳，陈双，毕晓娟，等.羟乙基淀粉一步与两步法分离骨髓单个核细胞及血小板比较.中国组织工程研究与临床康复，2010，14（40）：7529～8432.

3 Bourzac C， Smith LC， Vincent P， et al. Isolation of equine bone marrow-derived mesenchymal stem cells： a comparison between three protocols. Equine Vet J， 2010，42（6）：519～527.

4 Lapierre V， Pellegrini N， Bardey I，et al. Cord blood volume reduction using an automated system （Sepax） vs. a semi-automated system（Optipress II） and a manual method（hydroxyethyl starch sedimentation）for routine cord blood banking： a comparative study.Cytotherapy， 2007，9（2）：165～169.

5 迟占有，姜华，蔡海波，等.羟乙基淀粉沉降法分离脐血过程的深入分析及条件优化 .中国输血杂志，2004，17（2）：71～74.

6 Davis RH，Acrivos A.Sedimentation of noncolloidal particles at low reynold numbers.Ann Rev Fluid Mech，1985，17（1）：91～118.

7 郭继强，刘爱兵，沈丹.两步法分离羟脐血单个核细胞的最佳条件 .中国组织工程研究与临床康复，2011，15（45）：8447～8450.

210008南京医科大学附属南京儿童医院检验科