产质粒介导AmpC酶革兰阴性菌的耐药性分析及基因分型

莫焕桐 张健 陈新瑶 陈伟忠 朱伟东 陈淑贞

产质粒介导AmpC酶革兰阴性菌的耐药性分析及基因分型

莫焕桐 张健 陈新瑶 陈伟忠 朱伟东 陈淑贞

目的 分析潮州地区产质粒介导AmpC酶革兰阴性菌的耐药情况及基因分型，指导临床合理应用抗生素。方法 收集133株无重复多重耐药革兰阴性杆菌，行头孢西丁敏感试验、三维确证试验检测产质粒介导AmpC酶并分析其对12种常用抗菌药物的耐药性。同时对产质粒介导AmpC酶的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌进行AmpC酶基因分型。结果 133株菌中33株产质粒介导AmpC酶，发生率24.8%。15株产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中9株检测出3种基因型：MOX型株2株、DHA型株4株、MIR型株3株。产质粒介导AmpC酶菌株大多数耐药率＞80%，且呈多重耐药。结论 潮州地区革兰阴性杆菌产质粒介导AmpC酶发生率较高，菌种分布范围较宽，耐药性强，为提高革兰阴性杆菌的治疗效率，应当加强产质粒介导AmpC酶的监测。

革兰阴性杆菌 产质粒介导AmpC酶 耐药性 基因分型

革兰阴性杆菌是临床常见致病菌或条件致病菌，目前已成为医院感染的重要病原菌，尤其是产超广谱β-内酰胺酶和产质粒介导AmpC 酶的革兰阴性杆菌耐药性严重，其耐药性的变迁和多重耐药的出现，给临床治疗带来巨大困难。作者收集133株无重复多重耐药革兰阴性杆菌进行头孢西丁敏感试验、三维确证试验、同时运用PCR技术检测其基因型。报道如下。

1　临床资料

1.1一般资料 2011年1月至2013年12月分离自潮州市人民医院住院患者无重复多重耐药革兰阴性杆菌133株，其中痰液95份、尿液25份、咽拭子4份、脓液4份、腹水5份。同时做室内质控，质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922，由广东省临检中心提供；阴沟肠杆菌029M、大肠埃希菌DH5a2919、肺炎克雷伯菌ATCC700603，由汕头大学第一附属医院惠赠。采用法国生物梅里埃公司VITEK2 AST GN13药敏板进行抗菌药物敏感性试验。头孢西丁纸片均购自英国OXODI公司。利用AmpC酶对头孢西丁（FOX）耐药的性质，筛选耐药菌株。

1.2方法 （1）酶粗提液制备：挑取单个菌于6ml的LB肉汤中，35℃摇振培养过夜，于4℃、4000r/ min离心25min，弃上清液留沉渣-20℃冻融，反复冻融8次，加0.1mol磷酸盐缓冲液0.75ml，混悬沉渣，4℃，14000r/min离心lh，取上清液-20℃冷冻保存备用。（2）头孢西丁三维试验：将0.5 麦氏单位大肠埃希菌ATCC25922 菌液均匀涂布于MH 琼脂平皿，取一30μg FOX纸片置于平皿中心，用消毒200μl枪头粗端在距离FOX纸片5 mm 处对称打孔，用微量加样器在一孔加入酶粗提物60μl，另孔加入酶粗提物50μl+20mmol/L CLO10μl，避免加入液体溢出孔。35℃温箱培养过夜。如酶粗提物中含有 AmpC 酶，则在加入酶粗提物的孔与抑菌圈交接处由于 AmpC 酶水解 FOX，故出现扩大的长菌区，而由于AmpC 酶活性可被CLO抑制，所以在酶粗提物+CLO混合液的孔与抑菌圈交接处不出现扩大的长菌区，为 FOX三维试验阳性。如酶粗提物中无AmpC 酶，则两个孔与抑菌圈交接处均未出现扩大的细菌生长区，为FOX三维试验阴性。以E.cloacae 029M为阳性对照，E.cloacae 029 为野生型作为阴性对照。（3）PCR基因扩增：PCR检测质粒AmpC酶基因、引物的设计、PCR反应体系和反应条件参照参考文献［1］，质粒介导AmpC酶基因PCR引物序列（见表1）。PCR扩增AmpC酶基因，PCR试剂盒均购自无锡市克隆遗传技术研究所。总反应体积20μl（其中模板2μl）。热循环参数：93℃预变性2min，然后按93℃30s，55℃30s，72℃60s，共循环35次，最后72℃延伸2min。（4）PCR产物分析与测序：PCR产物在含0.5μg/ml溴乙啶的2%琼脂糖凝胶电泳中电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带判为阳性，用凝胶成像系统摄像保存后切胶回收纯化。

表1　质粒介导AmpC酶基因PCR引物序列

2　结果

2.1133株耐头孢西丁革兰阴性杆菌AmpC酶三维法试验结果 见表2。133株耐头孢西丁革兰阴性杆菌产质粒介导AmpC酶三维法试验阳性株数为33株，发生率为24.8%。

表2　133株耐头孢西丁革兰阴性杆菌AmpC酶三维试验结果

2.2AmpC基因检测结果 15株产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌有9株扩增出3种AmpC酶基因。见表3。

表3　15株产质粒AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌基因检测结果

2.333株产质粒AmpC酶菌对常用抗菌药物耐药率 见表4。

表4　33株产质粒AmpC酶菌对抗菌药物耐药率（%）

3　讨论

20世纪后期，抗生素的发现和应用明显降低了与感染相关的病死率。青霉素和头孢菌素等β-内酰胺类抗菌药物在长期使用中，细菌逐渐对其产生耐药性，使其抗菌作用减弱或消失，常出现使用效果不理想的现象［2］。目前，越来越多的研究表明［3］，革兰阴性杆菌对三代头孢菌素的耐药主要由高产AmpC酶介导。AmpC酶是由肠杆菌科和/或铜绿假单胞菌的染色体或质粒介导产生的一类β-内酰胺酶，是作用于头孢菌素且不被克拉维酸所抑制的β-内酰胺酶，故AmpC酶又称作头孢菌素酶。在多种革兰阴性杆菌的染色体上均存在编码AmpC酶的结构基因，在一定条件下，这类细菌可被诱导或基因突变而表达AmpC酶［4，5］。

本资料中133株耐头孢西丁革兰阴性杆菌产质粒AmpC酶株数为33株，发生率为24.8%。其中肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的发生率分别为24.4%、13.9%、22.7%、26.7%。产质粒AmpC酶菌还涉及其它9个菌种。表明耐头孢西丁革兰阴性杆菌产质粒AmpC酶检出率较高，并且菌种分布宽，因此应加强对耐头孢西丁革兰阴性杆菌产质粒AmpC酶菌株的鉴测。15株产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌有9株扩增出3种AmpC酶基因，其中大肠埃希菌6株、肺炎克雷伯菌3株，基因型分布为：MOX型株（大肠埃希菌1株、肺炎克雷伯菌1株）、DHA型株（大肠埃希菌2株、肺炎克雷伯菌2株）、MIR型株（大肠埃希菌3株）。其它株可能带有AmpC酶的其它基因型，后续将进一步进行其它基因型的检测。本资料表明本地区革兰阴性杆菌质粒介导AmpC酶有MOX型、DHA型、MIR型的存在。产AmpCβ-内酰胺酶是革兰阴性菌对广谱、超广谱β-内酰胺抗生素耐药的重要机制，其比ESBLs更宽的底物谱且对酶抑制剂不敏感造成临床治疗困难，质粒AmpC酶的出现和不断增加的种类以及在菌种之间的传递更加剧了这一耐药问题，本资料显示，产质粒介导AmpC酶菌株除对亚胺培南、头孢吡肟耐药性较低外，对其它抗菌药物均高度耐药，部分菌株耐药率＞80%，且呈多重耐药。因此研究简便、快速、准确的AmpC酶检测方法应用于临床实验室，对耐药菌进行检测、监控、指导合理正确使用抗生素，是控制、减缓耐药蔓延发展的迫切需要，另外更需要研制开发新一代抗生素和酶抑制剂来对抗细菌的耐药进化问题，这是解决临床细菌耐药的根本途径。

1 王冬国，周铁丽.质粒介导产AmpC酶大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌AmpC基因型检测与分析.中华医院感染学杂志，2007，17（7）：782～785.

2 江洁华，廖伟娇，徐军等.多重耐药革兰阴性杆菌产β-内酰胺酶的表型及基因型研究.中华医院感染学杂志，2007，17（5）：492～495.

3 余娴，袁斌，雷军.产“超-超广谱”β-内酰胺酶革兰阴性杆菌的耐药表型及基因分析.中国抗生素杂志，2011，36（1）：56～59.

4 Verdet C，Arlet G，Barnaud G，et al.A novel integron in Salmonella enterica serovar Enteritidis，carrying the bla（DHA-1）gene and its regulator gene ampR，originated from Morganella morganii.Antimicrob Agents Chemother， 2000 Jan，44（1）：222～225.

5 Barnaud G，Arlet G，Verdet C，et al.Salminella enteritidis：AmpC plasmid-mediated inducible beta-lactamase（DHA-1）with anampR gene from Morganella morganii.Antimicrob Agent Chemother， 1998 Sep，42（9）：2352～2358.

广东省潮州市科技计划项目（2013510）

521011广东省潮州市人民医院（莫焕桐 张健 陈新瑶 陈伟忠 朱伟东）515041 汕头大学医学院第一附属医院（陈淑贞）