雷帕霉素对人脐带间充质干细胞衰老抑制的作用研究

王巧玲　徐　辰　王　越　刘厚奇★

雷帕霉素对人脐带间充质干细胞衰老抑制的作用研究

王巧玲徐辰王越刘厚奇★

目的 通过探讨雷帕霉素对人脐带来源间充质干细胞（UC-MSCs）衰老的影响，推动其临床应用。方法 将人脐带间充质干细胞（MSCS）分为对照组及雷帕霉素组。β-半乳糖苷酶染色实验检测UC-MSC细胞内衰老相关β-半乳糖苷酶（SABG）的表达量；细胞计数试剂（CCK8）检测UC-MSC细胞的增殖；Real-time PCR检测UC-MSC细胞中衰老、增殖与干性相关 mRNA的表达。结果 与无水乙醇对照组相比，雷帕霉素组细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率及染色深度均降低；细胞增殖加快；增殖、干性基因升高同时伴有衰老相关基因的下降。结论 雷帕霉素能够减缓人脐带MSCs的衰老。

雷帕霉素 间充质干细胞 增殖 衰老

雷帕霉素的作用机制是PI（3）K家族相关丝氨酸苏氨酸蛋白激酶mTOR的活性，主要通过抑制mTOR复合体1（mTORC1），参与调控细胞生长以及代谢［1］。研究表明雷帕霉素能增加生命年限［2～4］。雷帕霉素可抑制BMSC体外培养时出现的衰老现象。本文自2013年12月至2014年6月实验资料旨在探究雷帕霉素对人脐带MSCs的作用，推动干细胞临床研究的发展。

1　材料与方法

1.1主要材料与试剂 人脐带MSCs（UC-MSCs）为本教研室库存。胎牛血清FBS、DMEM、0.25trypsin、青链霉素购自Gibco公司；雷帕霉素购自GeneOperation公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）及细胞衰老β- 半乳糖苷酶染色试剂盒购自碧云天公司；核酸提取试剂盒RNAiso Plus及逆转录试剂盒GoTaq Green Master Mix购自TaKaRa公司；实时荧光定量PCR试剂盒SYBR Master Mix （2×） kit购自Roch公司。引物由杰李公司合成。

1.2细胞培养与分组 UC-MSCs复苏后，培养于含FBS的DMEM培养液中，将处于对数生长期的细胞接种培养板，培养24h后按下列分组进行处理。（1）对照组：给予含1/1000无水乙醇的正常培养基。（2）雷帕霉素组：浓度为1pmol/ml、2pmol/ml、5pmol/ml的A、B、C三组，其中β-半乳糖苷酶染色实验只采用对照组与C组。

1.3β-半乳糖苷酶染色检测UC-MSC细胞衰老 将UC-MSC细胞接种于48孔板，只用对照组及C组，相应处理24h后，PBS洗涤1次，4%多聚甲醛固定15min，按说明书配置新鲜染色工作液150μl/孔，37℃孵育过夜。移除染色工作液，加入PBS后普通光学显微镜下观察、拍照。

1.4Cell Counting Kit-8 检测UC-MSC细胞增殖 取对数生长期UC-MSC细胞以每孔约2000个细胞接种于96孔中，分对照组、A、B、C四组，每组6个孔，无水乙醇及雷帕霉素处理48h后，每天检测每组的一个孔，连续6d。检测当天，更换培养液100μl，加入10μl CCK-8溶液，孵育2h后用酶标仪检测450nm波长处的吸光度。最终绘制一条增殖曲线。

1.5总RNA抽提和real-time PCR 将处于对数生长期的UC-MSC细胞接种于12孔板，采用无水乙醇及雷帕霉素处理48h后，去除培养液，用RNAiso Plus试剂盒按说明书抽提总RNA。酶标仪检测计算RNA浓度和纯度后，按相应试剂盒逆转录后，Real-time PCR检测相应mRNA 的相对表达量，以GAPDH作为内参。扩增条件：95℃ 5min；95℃20s，60℃ 15s，72℃ 20s，共40个循环。采用Applied Biosystems 公司StepOneTMSoftware（V2.1）计算各样本中目的基因相对表达量。实验重复≥3次，每组2复孔。PCR引物序列见表1。

表1　实时定量PCR引物序列

2　结果

2.1雷帕霉素能够降低UC-MSCs的衰老 β-半乳糖苷酶染色实验显示：本实验采用 C浓度处理组以及无水乙醇对照组两组细胞，光学显微镜下可见雷帕霉素组UC-MSC细胞呈现较低的β-半乳糖苷酶染色阳性率及染色深度，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2雷帕霉素能够增加UC-MSCs的增殖 本实验分A、B、C三个处理组及对照组，连续6d同一时间点进行CCK-8的检测。在干预3d后，各组增殖曲线开始出现改变，差异有统计学意义（P＜0.01） 。

2.3雷帕霉素增加细胞周期及干性正相关mRNA的表达，而降低衰老相关mRNA表达量 Real-time PCR主要检测了细胞周期、衰老相关基因cycline2、cycd1、cdk4、P16、P21、OCT4、NANOG等基因相对表达量，结果显示处理组及对照组各个基因的相对表达量的差异有统计学意义（P＜0.01） 。

3　讨论

间充质干细胞（MSCs）是一类残留于成体组织内的干细胞，具有自我更新、多向分化能力及较高的增殖能力［5］。然MSCs体外扩增培养一段时间后，逐渐失去其自我更新以及分化能力［6］。Gharibi B在骨髓来源间充质干细胞（BMSC）中发现阻滞PI3K/Akt/mTOR可以阻碍BMSC细胞老化相关表型的出现以及维持培养早期的形态，保持较高的克隆形成能力及增加增殖特性［7］。

本实验旨在探讨雷帕霉素对UC-MSCs衰老的作用，细胞的衰老是指细胞周期稳定阻滞同时伴有一定的表型改变，如功能的丧失、DNA损伤和损伤相关半乳糖甘酶（SABG）的升高等，其中SABG常用来确定体内组织的衰老［1］。β-半乳糖苷酶染色检测UCMSCs中SABG，确定雷帕霉素对UC-MSCs的衰老抑制作用表型；P16由INK4/ARF基因座编码，INK4/ ARF去抑制能显著引发衰老［8，9］。本资料结果表明雷帕霉素可以降低P16，而显著减弱UC-MSC细胞的体外培养衰老。CCND、CCNE及CDK4的表达可以推动G1期快速通过R限制点，实现细胞周期G1-S期的转变［10］。本资料中雷帕霉素呈浓度依赖性提高CCND1、CCNE2及CDK4的表达，提示其通过上调上述基因的表达而推动细胞周期的进程，促进细胞的增殖，抑制细胞衰老的发生的作用。最近研究表明，加入雷帕霉素或抑制mTORC1能够保存、甚至减缓体内组织中残留干细胞的功能［1］。mTOR 及其下游基因能长期维持人胚胎干细胞的自我更新［11］。雷帕霉素处理老年鼠能增加肠干细胞的功能［12］，保存造血干细胞（HSC）的自我更新及造血功能。雷帕霉素抑制mTOR活性后能够阻止干细胞衰老，增加口腔角蛋白细胞等表皮干细胞的自我更新及克隆形成能力，继而增强对放射治疗引起的黏膜炎的能力［8］，并可以调控干细胞的分化与维持其多能性。在诸多多能性因子中，OCT4、NANOG、SOX2是维持胚胎干细胞（ES）多潜能性和自我更新的关键基因，特别是OCT4的表达量可以精确的调控ES的多能性，目前大部分的体细胞重编程过程，大多均利用外源性过表达OCT4等多能性因子，促使体细胞成为多能干细胞或胚胎样干细胞，获得体外无限增殖及多向分化功能。BMSC中过表达OCT4、NANOG之后增加MSC细胞的增殖、分化潜能、抑制其内源性的分化［6］。人MSC中敲低P21后增殖加快，干性标志物亦相应增加［6］。本实验中雷帕霉素可以通过抑制UC-MSC细胞中OCT4、NANOG、P21多蛋白mRNA水平，获得较快的增殖与多能性。

UC-MSC细胞取材方便无痛，低免疫原性，高增殖，在临床应用方面更具优势，动物实验表明，UCMSCs能够改善自身免疫性脑脊髓炎小鼠的行为功能和组织病理损伤，可以显著减缓中脑动脉阻塞（MCAO）损伤模型鼠的局部损伤［13］，在体外的培养液伴有增殖的减慢、干性的丢失等一些列衰老表现，对于其机制研究及相应的减缓措施少有报道。本实验从上述三个方面探讨了雷帕霉素对UC-MSCs体外培养的衰老抑制作用及其可能作用机制，为UC-MSCs衰老的研究提供一个参考，为UC-MSCs体外培养及应用提供一个新的靶点及理论依据。

1 Johnson SC，Rabinovitch PS，Kaeberlein M.mTOR is a key modulator of ageing and age-related disease. Nature， 2013，93（7432）：338～345.

2 Harrison DE，Strong R，Sharp ZD，et al.Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice.Nature，2009，460（7253）：392～395.

3 Miller RA，Harrison DE， Astle CM，et al.Rapamycin，but not resveratrol or simvastatin ， extends life spanof genetically heterogeneous mice.J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2011，66（2）：191～201.

4 Vellai T，Takacs-Vellai K，Zhang Y，et al.Genetics：influence of TOR kinase on lifespan in C.elegans.Nature，2003，426（6967）：620.

5 Caplan AI，Correa D.The MSC： an injury drugstore.Cell Stem Cell，2011，9（1）： 11～15.

6 Tsai CC，Su PF，Huang YF，et al.Oct4 and Nanog directly regulate Dnmt1 to maintain self-renewal and undifferentiated state in mesenchymal stem cells .MolCell，2012，47（2）：169～182.

7 Gharibi B，Farzadi S，Ghuman M，et al.Inhibition of Akt/mTOR attenuates age- related changes in mesenchymal stem cells.Stem Cells，2014， 32（8）：2256～2266.

8 Iglesias-Bartolome R， Patel V， Cotrim A，et al.mTOR inhibition prevents epithelialste cell senescence and protects from radiation-induced mucositis. Cell Stem Cell，2012，11（3）：401～414.

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13 Cheng Q，Zhang Z，Zhang S，et al.Human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against ischemic brain injury in mouse byregulating peripheral immunoinflammation.Brain Res，2015，1594：293～304.

Objective To investigate the effect of Rapamycin in the senescence process of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells（UC-MSCs）. Methods UC-MSCs were divided into Rapamycin group and absolute alcohol control group.The measure of senescence-associated b-galactosidase （SABG） of UC-MSCs were detected by Beta galactosidase staining reagent.The proliferation performance of UC-MSC were examined by Cell Counting Kit-8（CCK8）.The expressions of senescence，proliferation and stemness relative mRNA were examined by real-time PCR. Results Compared with the absolute alcohol control group，The Rapamycin group show a lower positive rate and dyeing depth of Beta galactosidase staining. Rapamycin treated UC-MSCs present a higher rate of proliferation.The expressions of proliferation，stemness related mRNA were elevated，with an decrease of senescence relative mRNA. Conclusion Rapamycin slows down the senescence phenotype.

Rapamycin Mesenchymal stem cells Proliferation Senescence

200433 第二军医大学基础部组织学与胚胎学教研室