外周血NF-κB活性及血清GSH水平与2型糖尿病周围神经病变的关系分析

杨青青　李全民★　王　爽　杜瑞琴　颜　艳　胡晓强

外周血NF-κB活性及血清GSH水平与2型糖尿病周围神经病变的关系分析

杨青青李全民★王爽杜瑞琴颜艳胡晓强

目的 探讨糖尿病周围神经病变（DPN）与外周血核转录因子（NF-κB）活性及血清还原型谷胱甘肽（GSH）水平之间的关系，分析其在不同程度糖尿病周围神经病变中的变化及意义。 方法 85例2型糖尿病（T2DM）患者，分为不存在DPN、轻度、中度、重度DPN4组，健康对照组（N组）38名。测定其血清GSH水平及外周血NF-κB活性，进行统计学分析。结果 T2DM组较N组血清GSH水平下降、NF-κB活性升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。五组间两两比较显示各组间血清GSH水平及NF-κB活性比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。 结论 T2DM合并周围神经病变组血清GSH水平较单纯T2DM组下降、NF-κB活性升高，随着周围神经病变的加重，GSH水平显著下降、NF-κB活性明显升高。

2型糖尿病 周围神经病变 还原型谷胱甘肽 核转录因子

糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病神经病变中较常见的一种，发生多隐匿、渐进，可导致足部溃疡、坏疽和截肢等严重的后果，其早期诊断及治疗一直是研究的重点。还原型谷胱甘肽（GSH）是细胞内重要的抗氧化物，其可以清除自由基，降低细胞内氧化应激的活性。GSH的减少会加重体内氧化应激的状态。核转录因子（NF-κB）是炎症途径的重点，慢性NF-κB的活化可使神经元和血管对缺血再灌注损伤更敏感，从而参与糖尿病神经病变的进展。本实验通过检测不同程度糖尿病周围神经病变患者的外周血NF-κB活性及血清GSH的水平，探讨其与2型糖尿病（T2DM）及不同程度周围神经病变的关系。

1　临床资料

1.1一般资料 筛选2012年2月至10月中国人民解放军第二炮兵总医院内分泌科收治的105例T2DM患者，根据多伦多临床评分系统（TCSS）［1］进行 DPN的诊断及严重程度的分级后，纳入85例T2DM患者，分为4组：（1）A组（单纯T2DM）：不存在DPN组（0～5分），20例；（2）B组：轻度DPN（6～8分），22例；（3）C组：中度DPN（9～11分），22例；（4）D组：重度DPN（12～19分），21例。健康对照组38例，为同期体检健康人群。T2DM的诊断符合1999年世界卫生组织（WHO）T2DM诊断标准，排除有发热、尿频、尿急、尿痛症状和或尿菌、白细胞阳性等急、慢性尿路感染，肾结石、肾小球肾炎及间质性肾炎等泌尿系疾病，严重心、脑疾病，急慢性感染性疾病及恶性肿瘤，此外尿微量白蛋白定量（≥200 mg/L）的患者亦排除在外。1个月内患有糖尿病急性并发症（如酮症酸中毒、高渗性昏迷等）。嗜酒、吸烟及在过去5年内有吸毒或其他精神性药物滥用史者。

1.2方法 糖尿病病程从明确诊断至纳入研究为止，以“年”为单位。收缩压（SBP）和舒张压（DBP）取不同日清晨静息状态二次血压的平均值。脱鞋去帽测站立位身高及体重，计算BMI计算体质量指数［BMI=体重（kg）/身高2（m2）。所有观察对象均晚餐后空腹＞8h，次日晨起采集肘静脉血及尿液，送入生化室检测糖化血红蛋白（HbA1c）、血胆固醇（TC）、血甘油三酯（TG）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN），HbA1c采用高压液相法测定，余生化指标采用全自动生化分析仪测定。另收集血清冻存在-70℃冰箱，用于检测GSH及NF-κB。血清GSH水平的测定使用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定，外周血单个核细胞NF-κB活性的测定方法如下：所有受试对象于当天采用 EDTA 抗凝管抽取空腹静脉血10ml。在50ml管中加入20ml人淋巴细胞分离液，取EDTA抗凝静脉血10ml，与等量的Hanks液充分混匀，用滴管沿管壁缓慢注入到分层液面，注意保持清晰的分离界面。水平离心2000rpm，20min，离心后管内分3层，上层为血浆和Hanks液，中间层为淋巴细胞分离液，下层为红细胞和粒细胞，此外还有血小板。介于上层和中间层界面处还有一个以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带。用吸管插入到云雾层，吸取单个核细胞。另取15ml试管1支，加入Hanks液10ml，将吸取的单个核细胞置入，1500rpm，离心10min，加入重复1次，末次离心后小心吸出上清液弃去，加入含有20%胎牛血清的RPMI 1640，重悬细胞，后提取核蛋白，冻存在-70℃冰箱内保存，采用双抗体一步夹心法ELISA进一步测定外周血单个核细胞NF-κB活性，其板内及板间变异系数均＜15%。

1.3糖尿病周围神经病变检查及严重程度分级 在安静的环境中由同一内分泌科专业医生进行检查，房间温度控制在30℃左右，安静且放松；检查开始前，患者在房间内无寒冷的感觉；检查时避开胼胝或溃疡处；尽量使患者说出其最真实的感觉。所有患者均在知情同意、清醒、安静状态下进行TCSS检查，采用自行设计的调查表同期收集患者TCSS评分，记录TCSS神经病变分级，TCSS评分包括神经症状评分、神经反射评分及感觉功能检查评分3部分。神经症状包括下肢的麻木、疼痛、针刺样感觉、乏力及走路不稳及上肢相似症状，如正常计0分，存在相应症状计1分，共6分；神经反射包括踝反射及膝反射，为双侧计分，正常计0分，减弱计1分，消失计2分，共8分； 感觉功能检查包括右侧拇趾的痛觉、温度觉、触压觉、振动觉、位置觉5项，正常0分，异常1分，共5分，总分19分。按照Perkins 等的分级标准，0～5分者不存在DPN，6～8分者为轻度DPN，9～11分者为中度DPN，12～19分者为重度DPN。

1.4统计学方法 采用SPSS14.0统计软件。计量资料以（）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1一般资料 与健康对照组比较，T2DM组（A、B、C、D组）年龄、BMI、TC、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、肌酐（Cr）差异无统计学意义（P＞0.05），SBP、DBP、TG、BUN差异有统计学意义（P＜0.05）。T2DM各组年龄、BMI、血脂、血压、HbA1c、糖尿病病程比较差异均无统计学意义（P＞0.05）（见表1）。

2.2血清GSH及NF-κB活性在正常对照、T2DM及周围神经病各组的测定结果及比较 T2DM组较正常对照组血清GSH水平下降、NF-κB活性升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。随着周围神经病变的加重，血清GSH的水平下降、NF-κB活性渐升高，T2DM五组间两两比较显示各组间血清GSH水平及NF-κB活性比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1　单纯2型糖尿病组与糖尿病周围神经病变亚组一般情况和生化指标比较（x±s）

2.3相关性分析 血清GSH与病程（r=-0.319，P＜0.01）、NF-κB（r=-0.776，P＜0.01）呈负相关；与年龄、HbA1c、BMI、SBP、DBP、TC、TG、LDL-C、BUN、Cr等均不相关。NF-κB与病程（r=0.261，P＜0.01）、Scr（r=0.201，P＜0.05）呈正相关，与年龄、HbA1c、BMI、SBP、DBP、TC、TG、LDL-C、BUN等均不相关。logistic回归分析显示DPN与NF-κB呈正相关（P＜0.05）。

3　讨论

人们一直在寻找与DPN相关的血清标记物，为深入探讨DPN的发病机制及防治提供线索。NF-κB是Sen等［2］在分析B淋巴细胞核抽提物时最先发现的一种能与免疫球蛋白κ 链基因的增强子κB序列（GGGACTTTCC）发生特异性结合的核蛋白因子，因此将它命名为NF-κB。正常状态下NF-κB在胞浆内以非活化的形式存在，而胞核内微量的NF-κB主要起到维持正常生理功能的作用。高血糖状态下，糖代谢异常产生较多NF-κB的活化刺激因子，如IL-1、TNF-α等，且蛋白激酶C（PKC）的活化［3］、Ang-Ⅱ浓度的增加［4］等，均可引起p65的移位，活化NF-κB，且随着血糖水平的增高，对NF-κB激活作用逐渐增强，Kennefick等［5］在体外实验中将血管内皮细胞置入在不同浓度的高糖环境下，检测出NF-κB的活性随高糖的浓度增加而升高。活化的NF-κB除刺激炎症因子的释放和表达增加外，且能够产生放大效应。本资料结果提示随着糖尿病病程的延长，NF-κB的活化与表达成递增趋势，这可能与病程及高血糖状态持续时间的延长，进而导致更多炎症因子的释放、更多通路的开放相关。人体内氧化系统与抗氧化系统处于动态平衡中，但临床研究和基础实验均证实高血糖可使活性氧自由基（ROS）生成增多，导致氧化系统与抗氧化系统失衡。而NF-κB可能在ROS敏感信号途径的调节过程中起着关键作用［6］，是ROS、炎性因子信号调节途径的重要调节因子。

此外，NF-κB亦是炎症途径的重点，慢性NF-κB的活化可使神经元和血管对缺血再灌注损伤更敏感，从而参与糖尿病神经病变的进展。NF-κB可刺激内皮细胞、施旺细胞及神经元等释放细胞因子，引起巨噬细胞渗入增强，巨噬细胞增多又可进一步产生细胞因子，导致细胞氧化性损伤，影响神经元的再生。亦有研究证明，在糖尿病动物模型的脉管系统和周围神经中存在NF-κB/环氧化酶-2向上调节［7］。但NF-κB的活化可能是具有细胞特异性的，其在不同的细胞，在不同的诱导物作用下，所开启调控基因的表达是不一致的。鉴于其在促炎性基因表达和免疫功能调节中的重要作用，因此必须针对性地加以处理。同时NF-κB与其他转录因子之间的相互作用复杂，所以对于某一特定生理或者病理过程的意义也可能是不一致的。因此其在糖尿病周围神经病变中的作用和意义均有待于进一步的研究。

本资料结果提示T2DM患者与合并周围神经病变组患者血清GSH水平均下降，且随着周围神经病变的加重，GSH水平显著下降，血清GSH水平与病程、NF-κB活性呈负相关。GSH参与体内氧化还原过程，能和过氧化物及自由基结合，对抗氧化剂对巯基的破坏，保护细胞膜中含巯基的蛋白质和含巯基酶不被破坏，同时还可对抗自由基对重要脏器的损害。另有研究证实高血糖可使组织谷胱甘肽代谢异常，导致谷胱甘肽的依赖性H2O2降解机制受损害，从而使神经组织易受损伤［8］。

其他体外实验亦证实多元醇途径还可通过醛糖还原酶（AR）的过度表达，引起GSH的耗竭，激活NF-κB的表达，导致施旺细胞产生神经生长因子减少，致神经组织修复障碍［9］。多元醇代谢途径是一条经典的高血糖损伤途径，AR是该途径的关键酶，在神经组织的施旺细胞内含量最高，患者体内的高糖环境可引起AR活化，其活力的增高造成山梨醇等代谢产物的蓄积后，可改变细胞的渗透压、增加氧化应激反应，激活凋亡信号传导通路，诱导细胞凋亡。但AR的活化需要消耗辅助因子NADpH，而NADpH是细胞内生成GSH的协同因子。Song ZT等［10］研究发现转基因小鼠较非转基因小鼠坐骨神经中AR的活性增高、运动神经传导速度（MNCV）减慢、GSH含量下降。且有研究提示GSH治疗糖尿病周围神经病变，可显著提高DPN患者神经传导速度，其机制可能与其降低血浆ET-1水平有关［11］。另有研究显示TGFβ1可能与糖尿病周围神经病变相关［12］，且有研究显示TGFβ1升高可致核因子kappa B（即NF-κB）的激活［13］，并影响GSH的产生和维持［14］，进而参与糖尿病周围神经病变的发生、发展。

总之，外周血NF-κB的活性和血清GSH水平可能与糖尿病周围神经病变的发生、发展有关，对糖尿病周围神经病变的发病机制及防治有一定的参考价值。对于T2DM患者，不仅要使其血糖控制达标，抑制NF-κB的活性和升高血清GSH水平亦可能对糖尿病周围神经病变的发生及进展有益，但仍需进一步的研究证实二者与糖尿病周围神经病变的相关性。

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14 Roberts， R. A.， Michel C.， et al. Regulation of apoptosis by peroxisome proliferators. Toxicology Letters， 2004，149（1～3）：37～41.

Objective The aim of this study is to investigate the interrelationships between peripheral blood NF-kappa B activity，serum level of reduced glutathione（GSH）and type 2 diabetic peripheral neuropathy. In varying degrees of diabetic peripheral neuropathy，analyzing their changes and the signifi cance. Methods 85 patients with type 2 diabetes are divided into four groups：without DPN Group，with DPN of mild degree，with DPN of moderate degree，with severe degree of DPN. Normal control（N group）has 38 people.And all subjects determined the serum GSH level and peripheral blood NF-kappa B activity.Analyze the data observed in the study. Results There were signifi cant difference between DM group and N group in GSH and NF-κB（P＜0.01）. With the degree of peripheral neuropathy aggravated，the serum levels of GSH decreased，and the activity of NF-κB increased .There were signifi cant differences among the fi ve group in GSH and NF-κB（P＜0.05）. Conclusions Patients with type 2 diabetes mellitus had higher NF-κB activity and lower serum GSH level，with the degree of peripheral neuropathy aggravated，the serum levels of GSH decreased，the activity of NF-κB increased.

Diabetes mellitus，type 2 Diabetic peripheral neuropathy Reduced glutathione NF-κB

233000蚌埠医学院第一附属医院（杨青青 王爽 杜瑞琴 颜艳 胡晓强）100088中国人民解放军第二炮兵总医院（李全民）