羟乙基淀粉复合乌司他丁对保护重度休克大鼠肠通透性作用的研究

李宝永　蒲国华　许景伟

羟乙基淀粉复合乌司他丁对保护重度休克大鼠肠通透性作用的研究

李宝永蒲国华许景伟

目的 探究乌司他丁、羟乙基淀粉对保护肠黏膜控制内毒素（ET）通过通透性增强的肠壁进入循环血液的作用。方法 健康雄性大鼠85只，随机分为正常对照组（Ⅰ组，n=5）、重度休克组（Ⅱ组，n=40）、羟乙基淀粉乌司他丁干预重度休克复苏组（Ⅲ组，n=40），后两组又分为5个时相点，即1h、2h、4h、8h、16h，各时间点8只大鼠。采用比色法检测二胺氧化酶（DAO）表达变化。采用光度法检测ET表达变化。结果 Ⅲ组从复苏开始DAO含量即较Ⅱ组低近1倍，而且8hⅡ组达到了最高峰，而Ⅲ组却急速下降。两组比较差异有显著性（P＜0.01）。各组内不同时间点之间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。Ⅲ组的血清ET于1h时虽然较正常含量仍高出34倍之多，但较Ⅱ组要低近1倍，至16h时几乎接近了正常含量，两组比较差异有显著性（P＜0.01）。各组内不同时间点之间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 ET、DAO含量测定是判断小肠通透性改变的敏感性指标。羟乙基淀粉乌司它丁对于降低重度创伤-失血性休克后大鼠血中ET、DAO含量具有显著性效果。

重度休克 二胺氧化酶 内毒素 羟乙基淀粉 乌司它丁

大量研究表明，内毒素（ET）血症对重度创伤患者的转归起着重要的作用［1～3］。作者自2013年2月至2014年8月根据应用羟乙基淀粉及乌司它丁复苏后，通过测定不同时间窗大鼠血清二胺氧化酶（DAO）［4］、ET水平，以探究羟乙基淀粉及乌司它丁复苏对保护肠黏膜、控制ET通过通透性增强的肠壁进入循环血液的作用［5～7］。

1　材料与方法

1.1动物选择及分组 雄性SD大鼠85只（SPF级），体重（300±20）g，饲养5d，12h光/黑循环。实验大鼠分为3组：正常对照组（Ⅰ组，只=5）、重度休克组（Ⅱ组，只=40）、羟乙基淀粉乌司它丁干预重度休克复苏组（Ⅲ组，只=40）。Ⅰ组实验动物分别称重，由下腔静脉抽取血液3ml进行DAO、ET检测。Ⅱ组为重度休克组（只=40）：于1h、2h、4h、8h、16h不同时间窗由下腔静脉抽取血液3ml进行DAO、ET检测。Ⅲ组经股静脉输注羟乙基淀粉（0.02ml/g）乌司它丁（6U/g），然后在休克模型成功复制并稳定30min后1h、2h、4h、8h、16h不同时间窗，于下腔静脉抽取血液3ml，进行DAO和ET检测，每一亚组实验大鼠为8只，共40只。

1.2主要仪器及试剂 ET测定仪，BL-410生物机能试验系统，手术器械，分析天平，酶标仪，ET酶联免疫分析试剂盒，DAO酶联免疫分析试剂盒，羟乙基淀粉，乌司它丁。

1.3休克模型的复制 按照重度创伤-失血性休克大鼠模型标准［8］，取SD大鼠称重后，以10%水合氯醛（0.3ml/100mg）腹腔注射麻醉，固定并消毒。（1）分离一侧颈内动、静脉，行动静脉置管。颈动脉导管与BL-410生物机能实验系统相连，监测MAP。（2）分离右股动脉并插管，用于放血。（3）游离右侧股骨，咬碎股骨干后缝合。（4）经致内静脉导管注入肝素（1250U/kg）使全身肝素化后经股动脉导管缓慢放血，在10min内使MAP降至（35±5）mmHg，完成模型的复制。

1.4血清的采集及存放 常规消毒打开大鼠腹腔，显露下腔静脉及门静脉，分别留取静脉血3ml，4℃过夜，3000r/min，低温离心10min，取血清各0.3ml，分装EP管中置于-70℃冰箱保存备用（测DAO和ET）。

1.5ET的检测 用ET专用采血瓶加入1ml静脉全血，离心（1500r/min，10min），然后取0.2ml血浆加入稀释液瓶中（内含0.8ml稀释液），75℃水浴加热10min备用。在上机专用试管中加入0.1ml鲎试剂，再加入1ml已处理的备用液，使试管内溶液混匀，然后把各试管按编号逐次插入检测仪反应孔中，自动处理数据。

1.6DAO的检测 （1）将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫。（2）标本用标本稀释液1：1稀释后加入50μl于反应孔内。（3）加入稀释后的标准品50μl于反应孔、加入待测样品50μl于反应孔内。立即加入50μl的生物素标记的抗体。缓慢振荡混匀，37℃温育1h。（4）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复3次。（5）每孔加入80μl的亲和链酶素（HRP），缓慢振荡混匀，37℃温育30min。（6）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复3次。（7）每孔加入底物A、B各50μl，缓慢振荡混匀，37℃温育10min。避免光照。（8）取出酶标板，迅速加入50μl终止液，加入终止液后应立即测定结果。（9）在450nm波长处测定各孔的OD值。计算：以标准物的浓度为纵坐标（对数坐标），OD值为横坐标（对数坐标），在对数坐标纸上绘出标准曲线。根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

1.7统计学处理 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，采用单因素方差分析，各组数据均作正态性检验及方差齐性检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1血清DAO检测结果 见表1。

表1　血清DAO检测结果［U/L，（x±s）］

2.2血清ET检测结果 见表2。

表2　血清ET检测结果［pg/ml，（x±s）］

3　讨论

创伤-失血性休克是临床上常见的危重症之一。机体在发生创伤-失血性休克的发展过程中，肠道起着重要的作用［9，10］。肠道被认为是最大的革兰阴性杆菌ET池。生理解剖的特点决定了肠黏膜以及小肠绒毛是胃肠道缺血缺氧最敏感部位［11，12］，而且亦是恢复最晚的器官。休克发生后，胃肠道出现缺血［13～15］，其最早的表现即为肠道通透性增高，从而导致ET经肠黏膜吸收的增多。

DAO是人类和所有哺乳动物肠黏膜上皮绒毛细胞胞浆中具有高度活性的细胞内酶，在外周血中活性稳定，是反映肠黏膜上皮细胞成熟度和完整性的相对稳定的血浆标记物。其对肠黏膜损伤引起肠道通透性的增加早期诊断敏感而且特异性强。

ET是革兰阴性（G-）杆菌外膜的重要组成部分，正常肠道中，细菌在复制过程中外膜碎片不断脱落，使肠内游离ET处于高水平，即使有少量的细菌、毒素通过了肠道屏障，也会被肠道的淋巴组织，脾脏、肝脏的网状内皮系统所清除，不会对机体造成损害。当发生休克时，各脏器血流灌注不足导致缺血，肠道亦不例外，从而导致肠道屏障功能损伤，肠黏膜通透性增加，使细菌、ET透过肠道屏障移位入血；同时，发生休克时肠黏膜的免疫功能受损，机体不能有效地清除侵入的致病菌，亦是促使细菌、ET易侵入血的一个重要原因。本实验显示Ⅱ组的血清ET随着时间的推移在逐渐增加，较正常含量高出50余倍。而Ⅲ组的血清ET于1h时虽然较正常含量仍高出34倍之多，但较Ⅱ组要低近1倍，至16h时几乎接近了正常含量。两组比较差异有显著性（P＜0.01）。各组内不同时间点之间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

综上所述，ET、DAO含量测定是判断小肠通透性改变的敏感性指标。休克迁延时间越长，血中ET、DAO含量越高。羟乙基淀粉乌司他丁对于降低重度创伤-失血性休克后大鼠血中ET、DAO含量具有显著性效果。

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Objective To explore the effect of ulinastatin，hydroxyethyl starch on the protection of intestinal mucosal permeability.Methods Choose healthy male SD rats - 85 only normal control Group（divided into two groups at random，Ⅰ- Group，n=5），severe shock Group（Group～Ⅱ，n=40），Hydroxyethyl Starch and ΜLinastain for injection intervention severe shock to recovery Group（Group～Ⅲ，n=40），hind two groups and divided into fi ve time phase point，namely 1h，2h，4h，8h，16h，each time points，eight rats. Results Group III from recovery to begin DAO levels than group II nearly 1 times lower，and 8h II group reached its peak，and group III was falling rapidly. There was a signifi cant difference between the two groups（P＜0.01）. Between different time points in each group，the difference was statistically signifi cant（P＜0.05）. The serum ET III group in 1H was normal in content is still as much as 34 times higher than in group II，but lower than the nearly 1 times，to 16h is close to a normal content. There was a signifi cant difference between the two groups（P＜0.01）. Between different time points in each group，the difference was statistically signifi cant（P＜0.05）. Conclusion Determination of the content of ET，DAO is to determine the sensitivity of intestinal permeability change index. The effects of hydroxyethyl starch it Ding to reduce severe traumatic hemorrhagic shock ET，DAO content in the blood of the rats after signifi cant effect.

2 amine oxidase Endotoxin Hydroxyethyl Starch ΜLinastain for Injection

063000 河北联合大学附属医院