气相色谱-质谱法定性定量分析烟叶挥发性香气成分

李 勇， 林 茜， 逄 涛*， 师君丽， 孔光辉， 沐 雪

(1.云南省烟草农业科学研究院，云南玉溪 653100；2.玉溪师范学院，云南玉溪 653100)

烟叶挥发性香气成分是评价烟草及其制品品质的重要指标[1]。这些挥发性香气成分主要包括醛酮类化合物、呋喃类化合物、吡啶类化合物、吡嗪类化合物以及部分有机酸等。烟叶中许多挥发性香味成分可直接进入烟气，并对烟气的香气量、香气质等产生重要影响[2]。左天觉等[3]曾指出，烤烟香气风格的主要差异是致香成分间组成和比例不同而造成的。因此，全面、准确的定性定量分析烟叶中的挥发性香气成分对指导烟叶生产和卷烟科学配方等方面具有重要的意义。

目前，对不同来源的烟叶样品的挥发性香气成分进行了大量的应用研究[4 - 8]，采用的分析方法主要有气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)等。在定性方面，现有的分析方法主要是采用NIST和Wiley标准质谱库以及化合物的保留时间进行化合物定性[9]。这些方法简单易行，但由于色谱柱无法将所有化合物进行完全分离造成质谱图不纯、部分化合物含量太低而其质谱掩盖于质谱基质离子流中，以及不同化合物具有类似质谱图，因此存在着较大的错误定性的风险；采用保留时间定性则会由于色谱柱老化或者色谱柱之间的差异造成误差。在定量分析方面，现有的分析方法主要是对化合物的总离子流色谱图进行积分[10，11]，然后采用内标相对定量法进行定量。由于香气组分众多，色谱柱无法保证对所有组分的基线分离，因此采用总离子流积分就很难实现化合物的准确定量。

本研究采用色谱保留指数[12 - 14]、质谱去卷积和峰识别[15，16]、质谱库检索、标样定性等相结合的方法进行挥发性香气成分的定性，减少了色谱峰重叠、目标化合物离子流太弱、以及单一定性方法所带来的定性错误；采用选择离子检测的方法对所识别的香气成分进行定量，减少了峰重叠带来的定量误差。最终本研究确定了118个挥发性香气成分的定性定量信息。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

PE Clarus 600气相色谱-质谱仪(美国，PE公司)；改进型同时蒸馏萃取仪(N-SDE，国家烟草质量监督检验中心)；Rotavapor R-210旋转蒸发仪(瑞士，BUCHI公司)。

二氯甲烷(分析纯)；无水硫酸钠(分析纯)。

1.2 样品与标样

本实验采用的烟叶样品为2010年全国100个典型烟区大面积生产烤烟样品的等量均匀混合样。标准样品包括1-戊烯-3-酮等40种，纯度均大于98%。内标正十七烷，纯度大于99%。0#轻质柴油和汽油混合物(用于保留指数计算)购自当地加油站。

1.3 样品前处理方法

初烤烟叶去梗后在烘箱中于40 ℃条件下干燥4 h，粉碎过40目筛，密封于4 ℃冰箱保存。挥发性香气成分提取采用烟草行业常用的同时蒸馏萃取法[17，18]。处理的具体步骤参见文献方法[17]。

1.4 GC-MS条件

色谱分析条件：色谱柱为DB-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升温条件：50 ℃保持1 min，以5 ℃/min的速度升至160 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min的速度升至270 ℃，保持6 min；进样口温度为250 ℃；载气为氦气，柱流量为1.1 mL/min；分流比为20∶1；进样体积为2 μL。

质谱分析条件：传输线温度为230 ℃；溶剂延迟时间为1.9 min；质量扫描范围为m/z35～350；质谱数据采集速度为5 Hz，典型的烤烟样品色谱图见图1a。

图1 烟叶香气成分的总离子流(TIC)色谱图(a)及部分化合物的提取离子图(b&c)

2 结果与讨论

2.1 香气成分质谱去卷积

质谱去卷积是根据质谱碎片的色谱轮廓将属于同一化合物的质谱碎片归为一类，从而滤除干扰碎片的一种算法。本实验以香气成分中保留时间为2.75 min处色谱峰的质谱图为例，对比分析了香气成分在质谱去卷积前后的谱图差异和谱库定性差异(图2)。从图2可以看出，经质谱去卷积后，谱图明显较去卷积前干净。从质谱定性结果看，去卷积前后定性结果完全不同。去卷积前定性结果2-戊烯醛，定性参数中相似性、反相似性和可能性分别只有645、649和7，表明定性结果明显不可信。而去卷积后其定性结果为2-甲基-2-丁烯醛，定性参数中相似性、反相似性和可能性分别为950、986和93，显示其定性结果具有很高的可信度。从质谱去卷积前后的质谱定性结果可以看出，去卷积使得质谱图更纯净，因而能获得更可靠的定性结果。

图2 质谱去卷积前后质谱图比较

2.2 致香成分的定性分析方法

本实验采用质谱去卷积和谱图库检索、色谱保留指数、标准化合物验证相结合的方法进行化合物定性。考虑到相同保留机理的不同色谱柱、同一色谱柱在不同程序升温条件、不同柱流量条件下化合物的保留时间均会发生改变，本文采用正构烷烃的线性保留指数进行辅助定性。依据程序升温保留指数算法[12，13]，将正构烷烃(C6-C28)和化合物的保留时间带入保留指数计算公式，即可计算出化合物的保留指数(表1)。

表1 烤烟烟叶挥发性香气成分定性鉴定及定量评价结果

(续表1)

(续表1)

Note:tr,retention time;RI:retention index;RI ref.,retention index in references.The references were not listed here but can easily be found in the NIST library.QI,quantitative ion;S,similarity;R,reverse;P,probability;RSD,relative standard deviation;R2,correlation coefficient;#,components verified by standard compounds.

在质谱定性方面，由于气相色谱无法将样品中所有化学组分进行基线分离，某一时间点所获得的质谱信息可能来自一个以上的化合物。同时，响应较弱的化合物的质谱也可能被色谱柱流失或质谱干扰离子污染。基于此，本实验首先采用AMDIS软件进行质谱去卷积和峰识别，将属于同一化合物的质谱信息提取出来，并剔除干扰离子，然后再进行谱图库检索(图1b、图1c、图2b、图2c)。将相似度和反相似度均大于800的化合物列出，作为初步定性结果。将初步定性化合物在本实验中计算出的保留指数与该化合物的文献保留指数(由于每一个化合物的文献保留指数对应着不同的参考文献，此处不列出相关文献，但相关文献信息可以通过NIST 谱图库获得)进行对比，如果两者之间的差值小于10，则认为初步定性结果比较可靠。最后，对部分有标准化合物的初步定性化合物进行标样定性。即比对这些化合物的保留时间和质谱图是否与标准化合物完全一致。按照这种策略，本方法最终定性了118个挥发性香气化合物。

2.3 致香成分的定量分析方法

由于无法或者难以获得标准化合物，致香成分定量分析采用相对定量的方法。即假设待分析物在检测器上的响应与内标物一致，将致香成分的峰面积与内标物的峰面积相除，获得相对定量信息。本方法采用AMDIS自动去卷积和峰识别软件，获得了色谱分离中化合物相对于共流出(邻近)化学组分的特征离子，并将这些离子作为参考定量离子(表1)。使用参考定量离子定量积分，可以有效的降低重叠峰干扰，使色谱积分结果更为真实准确(图1b、图1c)。将获得的积分结果除以该离子在化合物中的响应丰度(可从NIST标准质谱库中获得)，即可获得该离子的总离子流响应强度，进行相对峰面积的定量计算。

2.4 重复性考察

采用内标相对定量的分析方法，对7个重复样品中所定性的118个化合物进行重复性考察。从整体上看，有60.2%的化合物的RSD差小于20%，80.5%的化合物的相对标准偏差(RSD)小于30%。对同一样品的7次重复进样发现，95%以上的化合物的进样重复性小于10%。这说明部分化合物的重现性较差的原因来自样品预处理步骤。从RSD与保留时间的关系看，在保留时间5 min以前，有88%的化合物RSD大于20%，在保留时间5 min以后，只有20%的化合物RSD大于20%。这可能是由于保留时间小于5 min 的化合物挥发性较强，同时蒸馏萃取和旋转蒸发仪浓缩时的细微误差即可引起测量结果的较大偏差。因此，在进行提取和浓缩的过程中一定要控制操作的每一个环节，确保强挥发性化合物的准确测量。化合物的具体RSD值见表1。

2.5 线性响应考察

由于无法获得所有化合物的标准样品，本方法通过对实际样品中所定性出的118个化合物在不同样品重量下的响应来考察化合物的线性响应情况。由于本方法在正常样品处理情况下每个样品重量为20 g，线性考察时分别取5、10、15、20、30、40、60 g样品进行分析，对所获得的定量信息进行线性考察。结果发现，在被分析的118个化合物中，有42个化合物的线性相关系数(R2)在0.99以上，适合于定量分析；38个化合物R2在0.90以上，比较适合于定量分析；另有38个化合物的R2小于0.90，不适合定量分析。从重复性考察结果可知，样品处理步骤带来了较大的误差可能是部分化合物的线性响应较差的原因。

3 结论

本文以烤烟烟叶香气成分的定性鉴定和定量分析为目的，采用质谱去卷积和峰识别、质谱库检索、色谱保留指数、标准化合物验证等方法共鉴定出118个烤烟香气成分。采用AMDIS软件，选取香气成分的特征定量离子，保证了定量分析的准确度。考察了所有被定性化合物的重复性和响应线性。分析了部分化合物重复性和线性不好的原因，为样品预处理方法的改进提供了理论依据。