液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法检测高砷煤矿区苔藓中的砷形态

张 萌， 张瑞雪*,2， 吴 攀,2， 官庆松

(1.贵州大学资源与环境工程学院，贵州贵阳 550025；2.贵州大学矿山环境治理工程技术中心，贵州贵阳 550025)

砷是一种具有毒性的类金属元素，其毒性不仅与元素总量有关，而且与其化学形态密切相关。研究表明，无机态的亚砷酸盐(As(Ⅲ))和砷酸盐(As(Ⅴ))的毒性较高，而一甲基砷酸(MMA)和二甲基砷酸(DMA)的毒性较小[1]。不同形态砷的物理和化学特性不同，因此具有不同程度的移动性、生物可利用性及毒性，砷形态是影响植物中砷的迁移和生物有效性的关键因素[2]。苔藓植物因其具有特殊的生理和代谢特征，被认为是指示污染程度和反应污染物最好的生物监测器[3]。因此，研究苔藓中砷的不同形态，对于进一步探讨砷在苔藓及其环境介质中的迁移转化有着重要的意义。目前，砷形态的研究大多集中在土壤、水、海产品、中药和极少数其他植物中[5]，且提取溶剂多采用甲醇-水混合液或酸溶液，其辅助提取方法主要有超声、微波和水浴提取。刘守廷等[6]研究表明，10%HCl振荡提取适合海生动物型海产品中砷形态；王亚等[7，8]用水-微波辅助提取法提取紫菜、微藻中砷形态；李莉等[9]用甲醇∶水(1∶9，V/V)混合液为提取液，在30 ℃超声提取烟草中砷形态；杨丽君[10]等用甲醇∶水(1∶9)混合液超声提取果蔬中砷形态；倪张林等[11]采用磷酸∶水(1∶99，V/V)作为花茶中砷形态的提取剂；吴烨飞等[12]用稀HCl为提取剂提取海藻中的砷形态；马杰等[13]用甲醇∶水(1∶9，V/V)超声浸提蜈蚣草根和叶中砷形态。不同植物的内部成分差异较大，因此针对不同植物样品中砷的提取方法研究必不可少[14]。

液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱(LC-HG-AFS)联用技术具有分析成本低、灵敏度高、选择性好、线性范围宽等优点[4]。本文初步探索了苔藓中砷形态的提取、分离与检测方法，考察不同浸提剂及提取条件下，采用LC-HG-AFS分析苔藓中砷形态的可靠性，以及实际苔藓样品中砷形态分布特征。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-AFS 97型原子荧光形态分析仪(北京海光仪器公司)；CEM Mars 6型微波消解仪(美国)；KQ-700DE型数控超声波清洗器；GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；LabTech ED54型智能样品消解仪(北京莱伯泰科公司)。

As(Ⅲ)标准溶液(GBW08666)、As(Ⅴ)标准溶液(GBW08667)、MMA标准溶液(GBW08668)、DMA标准溶液(GBW08669)，均购于国家标准物质中心，实验时将4种单标溶液配制成2 mg/L(以砷计)的储备液，4 ℃避光保存。H3PO4、HNO3、KBH4、KOH均为优级纯，甲醇为色谱纯。实验用水为超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm)。

1.2 样品前处理及测定

1.2.1样品总砷前处理及测定将采自贵州兴仁县高砷煤矿区的苔藓样品分别用自来水、超纯水洗净后，-40 ℃ 冻干至恒重，在冷冻条件下研磨，备用。样品消解采用电热消解法，称量0.1 g(精确至0.0001 g)的苔藓样品，放入50 mL的消煮管中，加10 mL HNO3-HClO4混酸(4∶1，V/V)，静置过夜，置于消解仪中于150 ℃消解至消解液澄清，赶酸后加入5%HCl、1%硫脲后定容至50 mL，用原子荧光光谱仪测定总砷，其仪器测定参数见表1。

1.2.2苔藓中砷形态前处理方法及测定水浴提取：称取冻干的苔藓粉末0.1 g(精确至0.0001 g)于50 mL离心管中，加入10 mL提取剂，95 ℃水浴提取40 min，3 000 r/min离心20 min，上清液过0.45 μm滤膜后，测定砷形态含量。微波提取：称取冻干的苔藓粉末0.1 g(精确至0.0001 g)于微波消解罐内，加入10 mL提取剂，微波消解温度5 min提升至90 ℃，保持30 min，3 000 r/min离心20 min，取上清液过0.45 μm滤膜后，测定砷形态含量。

1.3 液相色谱及HG -AFS条件

色谱柱为Hamilton PRP-X100阴离子交换柱(250×4.1 mm，10 μm)，流动相为1.791 g/L Na2HPO4与6.052 g/L KH2PO4溶液(0.45 μm滤膜过滤，超声脱气30 min)。具体仪器参数如表1所示。

表1 砷形态分析的LC-HG -AFS运行参数

2 结果与讨论

图1 不同浓度砷形态标准溶液的色谱图

2.1 砷形态分析的标准曲线、检出限与精密度

以20、40、80、100 μg/L(以砷计)的As(Ⅲ)、DMA、MMA和As(Ⅴ)混合标准溶液进样，得到不同砷形态的色谱图，如图1所示。在9 min内，4种砷形态完全分离，各形态砷的标准曲线线性良好，相关系数R2在0.9992～1.000范围。通过计算得四种砷形态的检出限为0.47～1.26 μg/L。取40 μg/L混合标准液重复进样5次，As(Ⅲ)、DMA、MMA、As(Ⅴ)的相对标准偏差(RSD)分别为1.23%、1.97%、2.14%和1.78%，均小于5%，表明所采用的仪器条件和实验方法可满足砷形态分析的需要。方法的线性范围、回归方程、相关系数、检出限等见表2。

表2 As(Ⅲ)、MMA、DMA、As(Ⅴ)线性方程、检出限、精密度(n=5)

2.2 苔藓中砷形态的提取

2.2.1苔藓中砷形态提取条件的选择实验首先比较了以纯水和甲醇∶水(1∶1、1∶3、1∶9)为提取溶剂，超声提取不同时间(10、20、30 min)的提取效果。结果显示，纯水在30 min时提取率最高，但仅为12.71%；而以1∶1和1∶3甲醇∶水的提取效率极低，且相同时间内随着提取溶剂中水的比例增加，其提取率增加。实验结果说明，甲醇∶水不适合用作苔藓中砷形态的提取溶剂。可能是由于在甲醇∶水介质中超声空化效应对苔藓结构破坏能力有限，导致砷形态提取率低。进一步比较了不同浓度的H3PO4(0.3、0.6、0.9 mol/L)、水、7%HCl作为提取剂，在微波和水浴作为辅助提取条件下对苔藓砷形态的提取效果(提取条件见1.2.2)。实验结果如表3所示，实验结果为3次平行实验数据的平均值。结果表明：7%HCl、水浴条件下，40 min对同一苔藓样品中砷的提取率最高，其提取率为94.48%～96.09%。苔藓中砷主要为无机形态，DMA、MMA由于浓度低于检出限，未检出。

表3 不同提取剂在水浴和微波条件下对苔藓中砷形态的提取结果

2.2.2苔藓中砷形态加标回收实验为验证方法的可靠性，对待测样品进行加标回收实验。根据样品中实际背景值情况，对As(Ⅲ)、DMA、MMA三种形态砷加标量为5 mg/kg，As(Ⅴ)加标量为10 mg/kg，5次重复测定。实验结果如表4所示，As(Ⅲ)、DMA、MMA、As(Ⅴ)加标回收率为91.40%～113.72%，表明本文方法可行。图2为苔藓中砷形态背景值和加标值的对比图谱。

表4 苔藓中4种砷形态的平均回收率和RSD(n=5)

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图2 苔藓中砷形态背景值(a)和加标值(b)的对比图谱

2.3 高砷煤矿区苔藓中砷形态分析

样品采集时间为夏季8月末，在研究区猫石头水库上游沿着矿山废水溪流流向，对溪流两旁优势种群花状湿地藓及其下表层土壤和溪流水进行样品采集，同时现场测定水样中pH、Eh、EC等易变参数。

对采集湿地藓采用7%HCl-水浴辅助提取，LC-HG -AFS法检测砷形态，结果见表5。由数据可见，研究区花状湿地藓中砷主要以无机形态的As(Ⅴ)和As(Ⅲ)存在，其中As(Ⅴ)含量最高，As(Ⅲ)次之，未检出MMA和DMA。且不同生长环境下的苔藓体内As(Ⅴ)和As(Ⅲ)含量差异性较大。因此可推断本研究区苔藓对砷的吸收能力受其生长环境的影响较大，这可能与该地区特殊的苔藓生长环境有关。

表5 溪流区7个采样点苔藓砷形态的测定

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3 结论

本研究初步探讨了对苔藓中砷形态的检测方法，该方法以7%HCl为提取剂，95 ℃水浴提取40 min，其提取率90%以上；用LC-HG -AFS联用技术对As(Ⅲ)、DMA、MMA、As(Ⅴ)四种砷形态进行测定，加标回收率为91.40%～113.72%，说明本方法准确可靠、可行。对高砷煤矿区酸性矿山废水溪流旁的苔藓中砷存在形式进行了研究，结果表明，本研究区花状湿地藓砷形态主要以As(Ⅲ)、As(Ⅴ)存在，且As(Ⅴ)的含量高于As(Ⅲ)含量。