交联透明质酸钠细胞支架材料中交联剂残留量的测定*

张治云，刘荣磊，陈建英，邢玉仁，王勤，凌沛学△

(1.山东省药学科学院，山东省生物药物重点实验室 山东 济南 250101；2.山东福瑞达医药集团公司，山东省黏膜与皮肤给药技术重点实验室，山东 济南 250101)

1 引 言

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-氨基葡糖双糖单位重复连接组成的一种链状聚阴离子黏多糖[1]，是构成皮肤、玻璃体、关节滑液和软骨组织的重要成分，具有独特的理化性质和生物学功能[2]。HA是软骨基质组成成分之一，作为软骨细胞生长的基质，能促进软骨细胞代谢，并维持软骨细胞表型、促进软骨基质分泌[3]，是构建复合软骨细胞支架的理想材料之一。天然的HA制备的支架材料具有良好的水溶性，但存在容易分散和被肌体组织中存在的酶及自由基降解，局部存留的时间较短的缺点，且缺乏维持支架材料所必须的力学性能[4]；而通过引入交联剂使链状的HA交联形成网状结构所得到的材料，可以在一定程度上克服上述天然HA材料的缺陷，通过调节交联程度及制备工艺参数，可获得具有适宜降解速度和适宜孔隙大小的材料，有望成为一种较理想的组织工程细胞支架材料[5]。HA常用的交联剂有二乙烯基砜(divinyl sulfone， DVS)和 1,4-丁二醇二缩水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether，BDDE)，比较而言，BDDE较DVS具有毒性小、反应性好等优点，正逐步取代 DVS 作为交联透明质酸(cross-linked hyaluronic acid，CHA)的主要交联剂[6]。由于BDDE化学性质活泼，其单体有致突变和致癌的潜在风险，因此，需要严格控制CHA支架材料中BDDE残留量。本研究建立了气相色谱法测定CHA细胞支架材料中BDDE残留量的方法，通过方法学研究证明方法专属性强、重现性好、灵敏度高，可用于CHA中BDDE残留量测定。

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

气相色谱仪(Agilent 7890A ，美国 Agilent)；自动进样器(Agilent G4513A)；氢火焰离子化检测器(FID) ；电子分析天平(Mettler XS205，瑞士 Mettler)。

无水乙醇(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20130514，色谱纯)；BDDE(美国Sigma—Aldrich)；CHA细胞支架材料(自制，批号：20130501、20130502、20130503)。

2.2 实验方法

2.2.1色谱条件 安捷伦HP-5(30 m×0.32 mm，0.25 μm)毛细管柱；进样口温度为200℃，不分流模式进样；FID温度为250℃；载气为氮气，流速为2.0 ml·min-1；柱温采用程序升温，初始温度为90℃，以15℃·min-1升温至250℃，保持8 min；进样体积为1.0 μl。

2.2.2试样的制备 精密称取BDDE 16.65 mg，置事先加入适量无水乙醇的50 ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0 ml置50 ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为贮备液，精密量取3.0 ml置25 ml量瓶中，加无水乙醇-水(6：4)稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取CHA细胞支架材料80 mg，精密称定，剪碎，置10 ml量瓶中，加水4.0 ml静置过夜，加无水乙醇稀释至刻度，强力振摇10 min，用0.22 μm有机微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3专属性试验 精密量取空白溶剂(无水乙醇-水=6：4)1.0 μl 注入气相色谱仪，记录色谱图；另精密量取BDDE 对照品溶液1 μl注入气相色谱仪，记录色谱图。

2.2.4线性关系试验 精密量取2.2.2项下BDDE对照品贮备液0.5、1、3、5、7 ml，分别置25 ml量瓶中，加溶剂(无水乙醇-水=6：4)稀释至刻度，摇匀，分别量取1 μl注入气相色谱仪，记录色谱图，以BDDE峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.2.5系统精密度试验 取2.2.2项下BDDE对照品溶液，按2.2.1条件连续测定6次，计算BDDE峰面积的精密度。

2.2.6对照品溶液稳定性试 BDDE对照品溶液配制后每隔一定时间，精密量取1 μl注入气相色谱仪，记录色谱图，考察BDDE峰面积随时间的变化趋势。

2.2.7定量限与检测限 取2.2.2项下BDDE对照品贮备溶液，逐级稀释成不同浓度的对照品溶液，依法测定，记录BDDE峰的信噪比。以S/N=10时为定量限，S/N=3时为检出限。

2.2.8重复性试验 取CHA细胞支架材料(批号：20130501)6份，每份80 mg，精密称定，依法测定样品中BDDE残留。

2.2.9回收率试验 取CHA细胞支架材料(批号：20130501)9份，每份80 mg，剪碎，置10 ml量瓶中，加水4.0 ml使充分溶胀；精密称取BDDE 13.32 mg，置事先加入适量无水乙醇的100 ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0 ml置50 ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。各取3份溶胀后的细胞支架材料，分别加上述对照品贮备液2.4、3.0和3.6 ml，加无水乙醇稀释至刻度，强力振摇10 min，用0.22 μm有机微孔滤膜过滤，取续滤液依法测定，计算BDDE回收率。

2.2.10样品测定 精密称取CHA细胞支架材料(批号：20130501、20130502、20130503)，各约80 mg，置10 ml量瓶中，依法测定样品中BDDE残留。

3 实验结果

3.1 专属性试验

空白溶剂进样，在BDDE出峰处无干扰峰，见图1。

图1 空白溶剂(A)及BDDE对照品溶液色谱图(B)

3.2 线性关系试验

在0.133～1.865 μg·ml-1范围内BDDE的浓度与峰面积的线性关系良好，相关系数为0.9993。

3.3 系统精密度试验

对照品溶液连续测定6次，BDDE峰面积RSD为1.86 % (n=6)，方法精密度良好。

3.4 对照品溶液稳定性试验

72 h内BDDE峰面积无明显变化趋势，RSD为2.42 % (n=8)，表明BDDE对照品溶液配制后至少在72 h内稳定。

3.5 定量限与检测限

BDDE定量限为0.104 μg·ml-1，检出限为0.036 μg·ml-1。

3.6 重复性试验

同一批次样品测定6次，均未检测到BDDE残留。

3.7 回收率试验

BDDE回收率见表1。

表1 BDDE回收率试验结果

3.8 样品测定

CHA细胞支架材料(批号：20130501、20130502、20130503)，均未检出BDDE。

4 讨论

细胞支架材料是组织工程领域的重要组成部分，理想的细胞支架材料应具有良好的生物相容性，适当的生物可降解性，易加工成形，并可在一定时间内保持外观和结构的完整性，具有一定机械强度能维持细胞形态和表型，并促进细胞粘附与增殖，诱导组织再生[7]。HA作为软骨细胞生长的基质，能促进软骨细胞代谢，是构建复合软骨细胞支架的理想材料之一，通过引入交联剂，使链状的HA交联形成网状结构，可延长材料在组织局部的存留的时间。

HA常用的交联剂有DVS和BDDE，由于交联剂化学性质活泼，单体有致突变和致癌的潜在风险，因此，需严格控制CHA中游离交联剂的残留量。朱彬等[8]、王悦等[9]采用气相色谱法测定DVS交联透明质酸钠凝胶中交联剂残留，样品处理采用乙醇萃取，使HA形成白色沉淀而DVS溶于乙醇中，直接进样测定。冯海等[6]采用荧光分光光度法和气相色谱法分别测定CHA凝胶中BDDE残留，两种方法定量限分别为0.53 μg·ml-1和1.85 μg·ml-1ml-1。自制CHA细胞支架材料为厚度1.5～2.0 mm的多孔状膜片，直接加乙醇，支架材料部分漂浮于乙醇中，不溶胀，不利于游离BDDE的提取。将支架材料剪碎后加适量水使其充分溶胀成凝胶，再加乙醇使CHA形成均匀絮状沉淀，可充分提取游离的BDDE，本试验通过色谱条件优化，采用不分流模式溶液直接进样，BDDE定量限为0.104 μg·ml-1ml-1，方法的检测灵敏度高于已报道的荧光分光光度法及气相色谱法。FDA批准的Restylane Silk Injectable Gel为采用BDDE交联的透明质酸钠凝胶，用于皮肤植入矫正口周皱纹，其浓度为20 mg·ml-1ml-1，产品中BDDE残留限值为2 μg·ml-1mg-1，折合成CHA中BDDE残留限值为0.1 μg·ml-1mg-1，参照该产品将CHA支架材料中BDDE残留限值暂定为0.1 μg·mg-1。