HPLC法同时测定不同产地香附药材中香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮

王世宇， 李文兵， 卢君蓉*， 季宁平， 傅超美， 严 鑫， 刘哿咿， 余佳丽

（1.成都中医药大学，四川　成都　611137；2.四川新绿色药业科技发展股份有限公司，四川　成都　611900）

HPLC法同时测定不同产地香附药材中香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮

王世宇1， 李文兵2， 卢君蓉1*， 季宁平1， 傅超美1， 严 鑫1， 刘哿咿1， 余佳丽1

（1.成都中医药大学，四川成都611137；2.四川新绿色药业科技发展股份有限公司，四川成都611900）

目的 建立HPLC法同时定量测定香附中3种特征性成分香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮，并对不同产地香附样品进行测定。方法 香附甲醇提取液的分析采用Phenomenex C18色谱柱（4.6 mm×250mm，5μm），流动相为甲醇-水（68∶32），检测波长为242 nm，体积流量为1.0 mL/min，柱温为30℃。结果 香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮进样量分别在0.260～0.912μg、0.028～0.098μg、0.082～0.286μg内呈现良好的线性关系，平均回收率分别为98.3%（RSD为1.5%）、97.9%（RSD为2.0%）、99.1%（RSD为1.4%）。海南、广东、广西、四川省的11批香附中香附烯酮为1.52～4.80 mg/g、圆柚酮为0.04～0.20 mg/g、α-香附酮为0.70～1.99 mg/g。结论 同一产地香附中3种成分含有量均呈现香附烯酮＞α-香附酮＞圆柚酮的规律。

香附；香附烯酮；圆柚酮；α-香附酮；高效液相色谱法

香附为莎草科植物莎草C yperus rotundus L.的干燥根茎，始载于《名医别录》，列为中品，具有疏肝解郁、理气宽中、调经止痛之功效，临床上常用于治疗肝郁气滞、胸胁胀痛、疝气疼痛、乳房胀痛等症［1］，被历代医家誉为“气病之总司，女科之主帅”。

香附主要含有挥发油类成分，如多种单萜、倍半萜及其氧化物，此外，还有黄酮类、三萜类、生物碱、蒽醌、酚类等化合物［2-3］。《中国药典》2010年版一部对香附药材及饮片的质量控制仅以挥发油的量为指标，缺乏有效成分的定量测定［4］，而国内对于香附质量控制的研究报道多以α-香附酮、香附中某一种黄酮成分或者总黄酮为评价指标，难以控制其药材及饮片的质量［5-6］。香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮为香附中含有量相对较高且药效活性明显的3种特征性成分，对于评价香附的质量具有非常重要的意义［7-10］。本实验采用HPLC法建立同时测定香附药材中香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮含有量的方法，并用于11个不同产地香附药材中3种成分的测定，为进一步评价不同产地香附药材的质量和完善香附的质量控制奠定基础。

1　仪器与试药

Agilent1200 Series高效液相色谱仪（G1312B四元梯度泵、G1322A脱气机、G1316B柱温箱、G1329B自动进样器、G1315C二极管阵列紫外检测器），赛多利斯Bp211DAG电子天平（德国Sartorius公司），超声波清洗器KQ5200DB（昆山市超声仪器有限公司）。

圆柚酮对照品（购于美国Sigma公司，批号10112423，纯度＞98%），香附酮（购于江西本草天工科技有限责任公司，批号1443-080529，纯度≥98%），香附烯酮（自制，纯度＞98%）。甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。不同产地的药材从各产地收集，经成都中医药大学卢先明教授鉴定为莎草科植物莎草C yperus rotundus L.的干燥根茎。

2　方法与结果

2.1色谱条件 Phenomenex C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为甲醇-水（68∶32）；检测波长为242 nm；体积流量为1.0 mL/min；柱温为30℃。在选定条件下，各色谱峰与样品中其他组分色谱峰达基线分离，其理论塔板数均大于4 000，见图1。

2.2对照品溶液的制备 取香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮对照品适量，精密称定，置于50 mL量瓶内，用色谱甲醇溶解并稀释至刻度，得混合对照品贮备液，质量浓度分别为0.651 2、0.070 2、0.200 4 mg/mL。精密量取上述贮备液1 mL，置10 mL量瓶内，用色谱甲醇溶解并稀释至刻度，得对照品溶液，质量浓度分别为65.12、7.02、20.04 μg/mL。

图1　香附的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatographs of Cyperus rotundus L.

2.3供试品溶液的制备 取香附粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。

2.4线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液，分别进样4、6、8、10、12、14μL，测定各色谱峰峰面积。以对照品进样量（μg）为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表1。

表1　3种特征性成分的线性范围考察Tab.1 Linear range of three characteristic constituents

2.5精密度试验 精密吸取上述混合对照品溶液10μL，重复进样6次，测定香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮峰面积，其RSD分别为0.9%、0.7%、1.0%，表明仪器的精密度良好。

2.6重复性试验 取同一批样品6份，分别按供试品溶液的制备方法制备，进样10μL，测定峰面积，计算。香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮含有量RSD分别为1.3%、1.0%、1.5%，表明该方法重复性良好。

2.7稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、16、24 h进样10μL，测定峰面积，计算。香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮RSD分别为1.4%、1.3%、1.6%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8加样回收率试验 取6份已知含有量的样品（广西钦州）约0.25 g，精密称定，分别加入对照品贮备液1 mL。按供试品溶液的制备方法制备，进样10μL，测定峰面积，计算回收率，结果见表2。

表2　香附中3种特征性成分加样回收率试验结果Tab.2 Results of recovery tests for three characteristic constituents in Cyperus rotundus L.

2.9样品测定 取不同产地的香附药材，用本实验所确定的方法进行样品处理和成分定量测定，结果见表3。

由表3可知，在实验所取11批不同产地的香附药材中均能同时检测香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮3种特征性成分的量，并且不同产地香附中香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮的含有量差异较大，其中香附烯酮为1.52～4.80 mg/g、圆柚酮为0.04～0.20 mg/g、α-香附酮为0.70～1.99 mg/g；同一产地的香附中3种成分的含有量也不同，且均呈现如下规律：香附烯酮量＞α-香附酮量＞圆柚酮量。

表3　不同产地香附药材中3种特征性成分测量结果Tab.3 M easurement results of three characteristic constituents in Cyperus rotundus L.from different growing areas

3　讨论与展望

3.1中药具有多成分、多靶点整体作用的特点，为使香附样品中各种成分都能达到较好的分离效果，在课题组前期研究和文献报道的基础上［11-12］，进一步对流动相、柱温、检测波长等进行了系统考察，最终确定色谱条件为：Phenomenex C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相为甲醇-水（68∶32），检测波长为242 nm，体积流量为1.0 mL/min，柱温为30℃。在该条件下香附中香附烯酮、圆柚酮、α-香附酮分离度良好，重复性好，且测定简便，可以用于样品中此3种成分测定。

3.2香附所含成分复杂，课题组在前期研究中运用GC-MS技术对香附挥发油所含成分进行初步研究［10］，在香附生品的挥发油中得到共有峰52个，并鉴定了其中46个峰，包括α-香附酮、圆柚酮、香附子烯、香附烯酮等成分。研究提示单用α-香附酮或者香附中所含的在自然界中分布广泛的木犀草素等黄酮类成分难以准确表征香附特征，更无法准确评价香附的质量。故课题组进一步筛选条件，从香附药材中分离制得香附烯酮对照品，并通过碳谱、氢谱及质谱研究确定其结构，采用HPLC法测定其纯度，便于定量测定之用。

通过对11批不同产地香附药材的测定进一步证实，香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮确为香附所含的3种特征性成分，并且同一产地香附中3种成分的含有量还具有一定的规律性。本研究结果对于香附的质量评价具有重要的意义，为进一步完善香附的质量控制奠定了基础，也为下一步深入研究香附疏肝解郁的物质基础与作用机理提示了方向。

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Determ ination of cyperotundone，nootkatone，andα-cyperone in Cyperus rotundus L.from different grow ing areas by HPLC

WANG Shi-yu1， LIWen-bing2， LU Jun-rong1*， JINing-ping1， FU Chao-mei1， YAN Xin1， LIU Ge-yi1， YU Jia-li1
（1.Chengdu Uniυersity of TCM，Chengdu 611137，China；2.Neo-Green Pharmaceutical Co.，Ltd，Chengdu 611900，China）

AIM To establish an HPLC determination for three characteristic constituents，cyperotundone，nootkatone，andα-cyperone，in Cyperus rotundus L.from differentgrowing areas.METHODS Phenomenex C18column（4.6 mm×250 mm，5μm）was used with themobile phase consisting ofmethanol-water（68∶32）at a flow of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 242 nm and column temperature wasmaintained at 30℃.RESULTS The good linear relationship of cyperotundone，nootkatone，andα-cyperone were in the range of 0.260-0.912μg、0.028-0.098μg，and 0.082-0.286μg，respectively.The average recoverieswere 98.3%（RSD 1.5%），97.9%（RSD 2.0%），and 99.1%（RSD 1.4%），respectively.The cyperotundone content fell within 1.52-4.80 mg/g，the nootkatone content within 0.04-0.20 mg/g，and theα-cyperone content within 0.70-1.99 mg/g in eleven batches collected from Hainan，Guandong，Guanxi，and Sichuan Province，China. CONCLUSION The method presents a content pattern，cyperotundone＞nootkatone＞α-cyperone，in Cyperus rotundus L.from the same growing area.

Cyperus rotundus L.；cyperotundone；nootkatone；α-cyperone；HPLC

R284.1

A

1001-1528（2015）03-0588-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.028

2014-03-04

国家自然科学基金青年基金项目（81303227）；成都中医药大学科技发展基金（ZRQN1412）

王世宇（1974—），女（回族），博士，副教授，从事中药新制剂、新剂型与中药质量标准研究。Tel：13708051074，E-mail：497217505@qq.com

卢君蓉（1988—），女，硕士，助教，从事中药新制剂、新剂型与中药质量标准研究。Tel：13688167921，E-mail：634589580@qq.com