HPLC法同时测定金鸡虎补丸中的去氢二异丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素

陈海燕

（广西卫生职业技术学院，广西　南宁　530023）

HPLC法同时测定金鸡虎补丸中的去氢二异丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素

陈海燕

（广西卫生职业技术学院，广西南宁530023）

目的 建立HPLC法同时测定金鸡虎补丸中去氢二异丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素4种成分。方法 金鸡虎补丸70%乙醇提取液的分析采用C18色谱柱（200 mm×4.6 mm，5μm）；流动相A为乙腈-甲醇（3∶2），流动相B为0.1%H3PO4溶液，梯度洗脱；体积流量为0.9 m L/min；去氢二异丁香酚检测波长为270 nm，五味子甲素、染料木素和芒柄花素均为254 nm；柱温为35℃；进样量20μL。结果 被测定的4组成分色谱峰均有良好的分离度，方法精密度、重复性的RSD均小于2.0%；在室温条件下24 h内稳定；各组分线性范围较宽，线性关系良好（r≥0.999 4）；平均加样回收率为96.8%～98.1%，RSD（n=6）≤1.4%。结论 金鸡虎补丸的提取方法和流动相保证了分析方法的简单易行、重复性好、准确可靠。

金鸡虎补丸；去氢二异丁香酚；五味子甲素；染料木素；芒柄花素；黑老虎根；鸡血藤

金鸡虎补丸是部颁标准中药处方制剂第一册所收载的品种，由黑老虎根、鸡血藤、狗脊、牛大力、骨碎补、大枣、桑寄生（盐酒制）、金樱子（盐制）、千斤拔等九味中药加工制成，除去包衣显棕色；味甘，微苦涩。具有补气养血、舒筋活络、健肾固精之功效，对水气凝滞、四肢麻痹、腰膝酸痛、夜尿频数、梦遗滑精等症状的治疗效果明显。目前，部颁标准仅对该制剂进行了简单的显微和显色鉴别，没有对处方中所含药物的任何成分进行定量分析，很难有效地控制产品的质量和疗效［1-2］。黑老虎根和鸡血藤为处方中的主要药物，去氢二异丁香酚和五味子甲素为黑老虎根的主要成分，芒柄花素和染料木素为鸡血藤的专属性成分，本实验采用HPLC梯度洗脱法同时对金鸡虎补丸中的去氢二异丁香酚、五味子甲素、染料木素［3］和芒柄花素［3］进行定量测定方法研究，为完善该制剂质量标准提供依据。

1　实验材料

1.1实验仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪、G1311A四元泵、G1330B自动进样器恒温器、G1322A脱气机、G1315B可变波长检测器、Chemstation色谱工作站；XP205型梅特勒电子天平（精度0.01 mg）。

1.2试药与试剂 去氢二异丁香酚对照品（批号111838-201102，纯度99.4%）、五味子甲素对照品（批号110764-201312，纯度99.6%）、染料木素（批号111704-201302，纯度99.1%）、芒柄花素（批号111703-200603，纯度100%）均购于中国食品药品检定研究院；金鸡虎补丸（水蜜丸，每瓶装60 g；批号分别为201401003、201401004、201401008）购于李时珍医药集团有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯，天津市津东天正精细化学试剂厂）；磷酸（分析纯，广州化学试剂二厂）。

2　试验方法与结果

2.1色谱条件 依利特C18柱（200mm×4.6mm，5μm）；流动相A为乙腈-甲醇（3∶2），流动相B为0.1%H3PO4溶液［4-10］，梯度洗脱（0～8 min，75.0%A；8～21 min，75.0%→60.0%A；21～43 min，60.0%A；43～50 min，60.0%→75.0%A）；检测波长（0～16 min，λ1=270 nm［11-13］；16～50 min，λ2=254 nm［14-15］）；体积流量0.9 mL/min；柱温为35℃；进样量20μL。此系统条件下所测组分与其他组分分离效果良好，理论塔板数按去氢二异丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素计均不得低于3 000，分离度均大于1.5。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液配制 精密称取去氢二异丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素4种对照品各适量，分别置于4个20 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并稀释至刻度，配制得去氢二异丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素质量浓度分别为1.025、0.698、0.530、0.595 mg/mL的对照品贮备溶液。再分别精密吸取上述对照品贮备溶液8、5、1、6mL置于同一个50 mL量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得去氢二异丁香酚、五味子甲素、染料木素与芒柄花素质量浓度分别为0.164 0、0.069 8、0.010 6、0.071 4 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 取本品适量，除去包衣，研细，混匀，取5.0 g，精密称定，精密加入70%乙醇50 mL，称定质量，超声处理30 min，取出，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3阴性对照溶液的制备 按金鸡虎补丸处方比例称取除黑老虎根的其余药味和除鸡血藤的其余药味各一份，按金鸡虎补丸的制备工艺分别制成黑老虎根空白样品和鸡血藤空白样品，按照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制成黑老虎根空白溶液和鸡血藤空白溶液。

2.3专属性试验 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、黑老虎根空白溶液及鸡血藤空白溶液各20μL，进行分析，结果见图1。供试品溶液中各待测成分色谱峰的分离度均大于1.5，而空白溶液色谱图在相应位置处未见色谱峰。

2.4线性关系考察 分别精密吸取“2.2.1”项下各对照品贮备溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，分别置于5个10 mL量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀。按“2.1”项下色谱条件进行分析测定，以峰面积Y与对照品质量浓度X线性回归，得去氢二异丁香酚回归方程为：Y=2.036 1× 104X-311.7，r=0.999 9，线性范围为10.25～205.00μg/mL；五味子甲素Y=5.974 2×103X+ 233.5，r=0.999 4，线性范围为6.98～139.60 μg/mL；染料木素Y=8.286 4×103X+307.7，r= 0.999 5，线性范围为5.30～106.00μg/mL；芒柄花素Y=1.276 5×104X-501.4，r=0.999 7，线性范围为5.95～119.00μg/mL。结果表明：去氢二异丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素在各自的线性范围内，所测组分质量浓度与峰面积线性关系良好。

2.5精密度试验 取混合对照品溶液，在“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，分别测得4种成分的峰面积，计算各成分相对标准偏差，去氢二异丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素RSD分别为0.6%、0.8%、0.9%、0.4%。结果表明，仪器精密度良好。

图1　去氢二异丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素的HPLCFig.1 HPLC of dehydrodiisoeμgenol，deoxyschizandrin，genistein and formononetin

2.6重复性试验 称取同一批号供试品，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件依法进样测定，记录各组分峰面积，计算相对标准偏差，结果去氢二异丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素的RSD分别为0.5%、0.8%、0.7%和0.4%。表明本法测定重复性良好。

2.7溶液的稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，在室温下放置0、2、4、8、12、24 h后，每次进样20μL，测定其峰面积值，结果去氢二异丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素的RSD分别为0.7%、1.0%、0.8%、0.6%。表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.8加样回收率试验 取已知含有量的同一批金鸡虎补丸（去氢二异丁香酚为1.569 mg/g、五味子甲素为0.681 mg/g，染料木素为0.132 mg/g，芒柄花素为0.716 mg/g）2.5 g，精密称定，精密加入混合对照品溶液25 mL、70%乙醇25 mL，称定质量，超声波超声处理30 min，取出，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液作为加样供试品试液。按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算各组分回收率，结果见表1。

表1　回收率试验结果Tab.1 Results of recovery tests

2.9样品测定 取3个批号的样品，按“2.2.2”项下供试品制备方法，按“2.1”项下色谱条件测定本品中去氢二异丁香酚、五味子甲素、染料木素和芒柄花素，结果见表2。

表2　样品测定结果（mg·g-1，±s，n=3）Tab.2 Results of content determ ination（mg·g-1，± s，n=3）

表2　样品测定结果（mg·g-1，±s，n=3）Tab.2 Results of content determ ination（mg·g-1，± s，n=3）

批号去氢二异丁香酚五味子甲素染料木素芒柄花素201401003 1.569±0.012 0.681±0.005 0.132±0.001 0.716±0.007 201401004 1.572±0.016 0.697±0.007 0.129±0.001 0.707±0.004 201401008 1.491±0.009 0.674±0.003 0.141±0.001 0.725±0.006

3　讨论

3.1色谱条件的选择 本实验考察了流动相乙腈-0.1%H3PO4溶液、甲醇-0.1%H3PO4溶液、乙腈-甲醇（3∶2）与0.1%H3PO4溶液不同比例进行梯度洗脱，结果以乙腈-0.1%H3PO4溶液为流动相梯度洗脱时染料木素和芒柄花素峰型对称，但五味子甲素与前一峰达不到分离；以甲醇-0.1%H3PO4溶液为流动相梯度洗脱时染料木素峰型不对称，拖尾现象严重；而以乙腈-甲醇（3∶2）与0.1%H3PO4溶液不同比例进行梯度洗脱时，所测4个组分均能达到基线分离，各组分峰型对称。

3.2超声提取时间的选择 在供试品制备过程中，曾分别考察超声提取10 min、30 min、60 min，结果表明超声提取30 min和超声提取60 min，所测得各组分的量差别不大，而超声提取10 min所测得成分量明显较低。故选取超声提取30 min作为供试品制备的超声提取时间。

［1］ 国家药典委员会.国家药品标准中药成方制剂第一册［S］.北京：人民卫生出版社，2004：98.

［2］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：180，附录30，附录36.

［3］ 王 楠，李占林，刘晓秋，等.黑老虎根化学成分的研究（Ⅱ）［J］.中国药物化学杂志，2012，22（4）：305-309.

［4］ 余燕影，章丽华，曹树稳，等.RP-HPLC法测定丰城鸡血藤提取物中大豆黄酮、染料木素、刺芒柄花素和美皂异黄酮［J］.中草药，2006，37（11）：1655-1656.

［5］ 黄 莉，张 洪，李华荣，等.RP-HPLC法测定鸡血藤合剂中芒柄花素的含量［J］.中医药导报，2013，19（9）：79-80.

［6］ 郭希庆.鸡血藤糖浆中芒柄花素含量的高效液相色谱法测定［J］.时珍国医国药，2013，24（11）：2657-2658.

［7］ 周会芹，郑 灏，支荣荣，等.HPLC法测定抗骨增生片中芒柄花素的含量［J］.首都医药，2013，20（16）：75-76.

［8］ 李 莹，陈晓辉，张天虹，等.RP-HPLC法测定鸡血藤中芒柄花素的含量［J］.沈阳药科大学学报，2009，26（12）：975-977.

［9］ 马 强，周玉新，雷海民，等.HPLC测定红车轴草中大豆苷元、染料木素、芒柄花素和鹰嘴豆芽素A的含量［J］.中成药，2005，27（10）：1193-1195.

［10］ 尤春雪，张振秋，侯学智，等.HPLC波长切换技术同时测定升麻、葛根药对提取物中11个成分［J］.中成药，2013，35（4）：761-765.

［11］ 吴 梅，阿 萍，周雪杉，等.二十味肉豆蔻丸质量标准研究［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（19）：111-114.

［12］ 刘晓哲.多波长RP-HPLC法同时测定肥儿丸中木香烃内酯、去氢木香内酯、去氢二异丁香酚［J］.中成药，2014，36（1）：98-101.

［13］ 张林林，王永吉，李 航，等.UFLC法同时测定护肝胶囊中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素［J］.中成药，2013，35（1）：96-99.

［14］ 梁永枢，安 冉，刘军民，等.不同产地鸡血藤药材中染料木素及芒柄花素的含量测定［J］.时珍国医国药，2013，24（7）：1655-1657.

［15］ 章运典，周里欣，薛素娟，等.RP-HPLC法测定脑力宝丸中5种成分［J］.中成药，2014，36（4）：776-779.

Determ ination of dehydrodiisoeugenol，deoxyschizandrin，genistein and formononetin in Jinji Hubu Pills by HPLC

CHEN Hai-yan
（Guangxi Medical College，Nanning 530023，China）

AIM To develop an HPLC method for simultaneously determining four components，such as dehydrodiisoeugenol，deoxyschizandrin，genistein and formononetin in Jinji Hubu Pills.METHODS The chromatograhic separation of 70%ethanolic extract of Jinji Hubu Pillswas performed on C18column（200mm×4.6 mm，5μm）.Mobile phase consisted of acetonitrile-methanol（3∶2）（A）and 0.1%phosphoric acid solution（B）were adopted at the flow rate of0.9mL/min.The detection wavelengthswere 270 nm for dehydrodiisoeugenol，254 nm for deoxyschizandrin，genistein and formononetin，respectively.The column temperaturewas35℃.The injection volume was 20μL.RESULTS The four compoundswere well separated.The RSD values of precision and reproducibility were all less than 2%.The stability was good in 24 h.The linear relationship between the concentration and peak areas of the four compoundswas all greater than 0.999 4.The recoveries were 96.8%-98.1% and RSD（n=6）less than 1.4%.CONCLUSION The developed extraction and mobile phase were simple，sensitive，accurate，and reproducible for Jinji Hubu Pills.

JinjiHubu Pills；dehydrodiisoeugenol；deoxyschizandrin；genistein；formononetin；rootof Kadsurae Coccineae；Spatholobi caulis

R927.2

A

1001-1528（2015）03-0538-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.017

2014-07-27

陈海燕（1971—），女，硕士，讲师，主要从事药物检验分析和药物化学教研工作。Tel：（0771）5323196，E-mail：chenhaiyanlunwen@163.com