对虾白斑病毒1197基因的表达和产物纯化的研究

陈舒贞?张思萍

摘 要：目的 对对虾白斑病毒1197基因的表达和产物纯化进行研究。方法 对对虾白斑病毒的早晚期基因1197基因的表达和产物纯化进行研究，构建PGEX—3Xll97表达质粒，以及在大肠杆菌DE3中表达PGEX—3Xll97，对表达物进行纯化。使用FPLC的方法对融合蛋白进行纯化，并对表达产物进行复性处理。结果 将对虾白斑病毒1197基因与PGEX—3X载体进行连接，并鉴定PCR和酶切。在大肠杆菌DE3中，PGEX—3Xll97得到了表达和产物纯化的融合蛋白。结论 本研究对对虾白斑病毒1197基因的表达和产物进行了纯化，得到了1197基因表达的融合蛋白。

关键词：产物纯化;对虾白斑病毒;1197基因

上个世纪末以来，我国养殖对虾的死亡现象就时有发生，给对虾养殖户带来了巨大的损失。在研究中发现，能够在体外对对虾白斑病毒的早晚期基因1197进行切割。本文主要是对1197基因进行原核表达，并对其表达的产物进行纯化，从而进一步的研究1197基因表达产物的功能。

一、材料与方法

1. 材料

使用本实验室的对虾白斑病毒1197基因，在E61质粒中进行构建。使用TaKaRa公司生产的BamHI和EcoRI内切酶，Phaonacia公司生产的PGEX—3X，本组保存的菌株E.coliDE3、E.eoliDH5a、以及其他的分析纯试剂。

2.方法

（1）构建PGEX—3Xll97表达质粒

使用E61质粒作为模板，以1197基因读框3及5端顺序为依据，将下游引物和上游引物合成，并将其在50μLPCR反应混合液中对其进行94℃5min的变性，并对其进行30循环扩增。用1.0%琼脂糖凝胶电泳对产物进行鉴定。用BamHI和EcoRI双酶切PGEX—3X，并使用低熔点胶回收法来对产物进行转化、常规连接和纯化。经过转化得到了含有DE3钙细胞的菌株，并对其含有1197基因的重组表达质粒进行鉴定。

（2）在大肠杆菌DE3中表达PGEX—3X1197

将含有PGEX—3X1197质粒的大肠杆菌DE3单菌落培养出来，将其加入300mL的LB培养瓶，比例为1：100。

（3）纯化表达产物

对纯化融合蛋白使用谷胱甘肽亲和层析柱分离，并收集样品。对融合蛋白使用FPLC的方法进行纯化。对包涵体进行处理，使用300mL的菌液进行破菌，并进行10分钟的离心，在3mL裂解缓冲液中进行沉淀悬浮。

对纯化融合蛋白使用FPLC进行分离，并适当浓缩包涵体样品，使用A缓冲液进行透析，用微孔滤膜过滤样品，并进行2mL的上样。设计合适的NaCI浓度梯度，并对离子交换柱进行洗脱，对样品进行收集。

（4）对表达产物的进行复性处理

主要是在27mL溶解缓冲液溶液中缓慢的加入经过处理的包涵体，依次透析PBS、2mol/L尿素、4mol/L尿素、6mol/L尿素。离心所得到的样品，然后使用谷胱甘肽S—转移酶亲和层对上清液进行分离纯化。

二、结果

1.鉴定与构建表达质粒PGEX—3X1197

以已知的对虾白斑病毒1197的基因序列3端及5端为基础，将下游引物P2和上游引物P1合成出来，在对其进行扩增，将对虾白斑病毒1197基因得出来，并将其与载体PGEX—3X进行连接，进行PCR鉴定和酶切鉴定。

2. 纯化大肠杆菌DE3中PGEX—3X1197的产物

可以将PGEX—3X的表达质粒进行编码，然后将含有外源读框的DNA片段插入，将连接外源基因产物的融合蛋白表达出来，并使用GST亲和柱进行纯化。然而由于包涵体包涵了该基因的产物，难以进行纯化。

用8M尿素处理包涵体，在融合蛋白在透析后的上清中含量较高，进而对其进行进一步的透析，仍然没有得到纯化的融合蛋白。对包涵体进行处理，并用FPLC阴离子交换层析法对上清样品进行分析，得到了4个小峰。根据对小峰的鉴定，得到了融合蛋白。

三、讨论

从上世纪末开始，我国出现了对虾白斑病毒，主要症状是虾体的头胸甲部位出现白斑，给我国的沿海对虾养殖业造成了巨大的损失。当前的研究表明，在5‘端非编码区，1197基因具有AAGGTT早期基因启动子元件、GTGT结构域、TATA box。因此本文认为这是一个病毒蛋白的调控因子，其能够参与病毒复制。在本次研究中，载体使用了pGEx—3x表达，并对构建表达质粒进行克隆，对大肠杆菌中的pGEX3X—1197进行表达和诱导。

经过研究发现，在大肠杆菌的包含体重，该基因产物语其他基因产物有所不同，尽管裂解包含体之后能够获得较高表达量的产物，但是却具有较大的纯化难度。要使用去垢剂来裂解包含体、分离蛋白质，例如盐酸胍和尿素、SDS等。这也导致了表达产物的变性率较高，难以进行纯化分离。

本次试验使用的方法是蛋白质复性方法，在尿素中进行从高浓度到低浓度的透析，但是效果仍然不理想。这是由于GST的亲和层析柱难以进行结合。最后，本实验使用了透析包涵体、盐酸胍和尿素处理，并在离析中使用了FPLC阴离子，从而实现了对该基因表达的融合蛋白的成功纯化，此时NaCI梯度浓度为30%。至于该蛋白质的功能是否会受到尿素引起的变性作用的影响，还需要进行进一步的考证。

参考文献：

[1] 姚翠鸾， 王志勇， 相建海.甲壳动物精氨酸激酶的结构与功能[J]. 中国生物化学与分子生物学报， 2008， 27（3）：23–28.

[2] 姚翠鸾， 冀培丰， 孔鹏， 等.凡纳滨对虾精氨酸激酶的多克隆抗体制备及组织特异性表达分析[J].水产学报，2009， 33（1）： 1026–1030.

[3]李蓓蓓，张帆，薛强，等.新城疫病毒胶体金免疫層析试纸条的制备[J].中国畜牧兽医，2009，36（9）：122-125.

[4]郝振明，赵鑫，吴孝槐.超分枝滚环扩增技术结合试纸法检测食品中多种转基因组分 [J].食品科学，2010，31（6）：263-266.

[5]彭姣，王洪强，李登峰，等.HRCA技术检测中华鳖虹彩病毒[J].微生物学通报，2013，40（2）：341-349.

[6]兰萍，宋晓玲，张辉.免疫增强剂在对虾生产中的研究与应用现状[J].动物医学进展，2008，29（10）：65-68.