大孔吸附树脂分离纯化昆仑雪菊总黄酮工艺的研究

木合塔尔·吐尔洪， 木尼热·阿不都克里木*， 热阳古·阿布拉, 夏 娜

(喀什大学化学与环境科学学院，新疆喀什 844000)

昆仑雪菊(Kunlun Snow Daisy)，又名“血菊”、“金鸡菊”，维语“古丽恰尔” ，学名为两色金鸡菊( Coreopsis Tinctoria Nutt)，属于菊科金鸡菊属，一年生草本植物的干燥头状花序，是一种具有新疆区域特色的菊花品种，主要分布在海拔3 000米的新疆和田昆仑山北麓[1,2]。昆仑雪菊花期短，产量稀少，是新疆目前唯一与雪莲齐名且具有独特功效的稀有高寒野生植物，具有调节三高、减肥养颜、抗菌消炎、营养心肌、改善睡眠质量等功效。昆仑雪菊是维吾尔族世代传承下来的一种养生、保健的天然植物。维吾尔民族医药理论认为昆仑雪菊具有高效降血脂、软化血管、去除体内垃圾，达到人体的体液平衡，主要对冠心病、高血脂、糖尿病有着特殊的疗效。昆仑雪菊生物活性多样，清香宜人，具有极佳的药力作用，是天然保健功能极高的饮用品种。在药品，食品、保健用品、保健食品等诸多领域具开发应用价值[3]。

大孔吸附树脂是近年来发展起来的有机高聚物吸附剂,在中草药化学成分的分离、富集中的应用日趋广泛，其优点在于吸附容量大，再生简单，效果可靠，适合于分离纯化总黄酮成分。2012年，娄方明报道了大孔吸附树脂分离纯化巫山淫羊藿总黄酮的方法，实验结果表明AB-8型大孔树脂对巫山淫羊藿总黄酮的吸附总量、解吸附率、吸附速率均大于其他树脂，纯化后总黄酮含量可达70.20%[4]。2014年，沈先荣等人报道了大孔吸附树脂分离纯化枇杷花总黄酮工艺研究，结果显示DM301树脂对枇杷花总黄酮具有良好的吸附分离性能，产物经干燥后总黄酮质量分数最高可以达到80%以上[5]。本实验对11种大孔树脂进行了比较，采用静态吸附方法筛选出纯化昆仑雪菊中总黄酮的最佳树脂，并对该大孔树脂纯化昆仑雪菊总黄酮的工艺条件进行系统的研究，以期为开发昆仑山雪菊总黄酮为主要成分的中药新药提供物质基础。因为昆仑雪菊中黄酮的主要成分是芦丁，所以实验中选用芦丁作为对照品进行分析。

1 实验部分

1.1 仪器与药品

T6型新世纪紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；FA2104N电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；HWS24型电热恒温水浴锅(上海-恒科学仪器有限公司)；SHZ-3水循环真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；RE5298A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。

芦丁对照品(纯度为99.8%，中国药品生物制品检定所，编号:100080)；NKA-9大孔吸附树脂，AB-8大孔吸附树脂0101型，大孔苯乙烯系敖合性树脂D401，大孔强酸性苯乙烯阳离子交换树脂DO72，大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂D301，大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂D290，弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂D110，HZ-816大孔树脂，HZ-806大孔树脂；HZ-818大孔树脂，D315大孔树脂，均购自天津市光复精细化工研究所；Na2SO3，Al(NO3)3，无水乙醇，NaOH等试剂均为分析纯。实验用水为蒸馏水。

昆仑雪菊(新疆和田地区民丰县山区)经喀什师范学院生物与地理科学系司马义教授鉴定。

1.2 昆仑雪菊总黄酮含量测定[6 - 8]

1.2.1对照品溶液的制备精确称取恒重的纯度为99.9%芦丁标准品 20.08 mg,置于50 mL容量瓶中，加20 mL无水乙醇，超声使其溶解后，用乙醇定容至刻度，摇匀。即得浓度为0.4016 mg·mL-1芦丁标准储备液。

1.2.2供试品溶液的制备取昆仑雪菊50 g,加入20倍量的水,煮沸提取3次,每次2 h,过滤,合并滤液,用旋转蒸发器浓缩成浸膏。精密称取昆仑雪菊浸膏1 g，置于100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度作为供试液。

1.3 昆仑雪菊总黄酮的分离纯化[9 - 11]

1.3.1大孔树脂的预处理与再生用0.5 BV(1 BV为1个树脂床体积)的乙醇浸泡树脂24 h。用2 BV的乙醇以2 BV/h流速通过树脂柱，并浸泡4到5 h，用乙醇2 BV/h 的流速洗涤树脂至流出液加水后不呈白色混浊为止。再用水以同样流速洗净。用2 BV的5%HCl以4到6 BV/h 的流速通过树脂层，并浸泡树脂2到4 h，后用水以同样流速洗至流出液pH值为中性。用2 BV的2%NaOH溶液以4到6 BV/h 的流速通过树脂层并浸泡树脂2 h到4 h 后，用水以同样流速洗至流出液pH值为中性。

1.3.2大孔树脂的筛选及上样量的确定精确称取预处理好的湿树脂3 g，置于磨口锥形瓶中，加入30 mL昆仑雪菊黄酮的粗提取液，盖好瓶塞，在室温下连续搅拌12 h，充分吸附后过滤，测定滤液中剩余总黄酮含量，计算总黄酮的吸附量和吸附率。向滤去吸附液的树脂中加入60 mL 一定浓度的乙醇，在室温搅拌4 h后过滤，测定滤液的总黄酮含量,计算总黄酮的洗脱率。

1.3.3吸附液pH值的确定分别取5份供试液50 mL，用5%HCI分别调节pH值为2、3、4、5、6后，加入到一系列1.0 g已去表面水的最佳的树脂中，振荡吸附24 h，测定吸附后溶液中总黄酮含量，计算出树脂的吸附量，根据树脂的吸附量的结果选择最佳pH值。

1.3.4洗脱剂乙醇浓度的确定按照1.3.2中方法过滤吸附已达饱和树脂，加入适量水洗涤，分别置于有玻璃塞的磨口锥形瓶中,依次加入40 mL 30%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇进行解吸，测定洗脱液中黄酮含量,计算出树脂的吸附量，根据树脂的吸附量的结果选择最佳乙醇的浓度。

2 结果与讨论

2.1 紫外-可见分光光度法测定昆仑雪菊总黄酮含量

2.1.1标准曲线的绘制分别精确吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL芦丁标准储备液，分别置于25 mL量瓶中，加6 mL无水乙醇,再加5%Na2SO3溶液 1 mL，混匀，放置 6 min后加10%Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀，放置 6 min，加4%NaOH溶液10 mL，再加无水乙醇至刻度，摇匀，放置 15 min，以无水乙醇为空白，在510 nm 波长处测定吸光度。以芦丁标准溶液浓度(c)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得标准曲线方程为：A=15.508c-0.0044，芦丁浓度在0.008～0.080 mg·mL-1范围内呈良好的线性关系，相关系数r=0.9995。

2.1.2显色稳定性试验精确吸取0.5 mL芦丁标准溶液至25 mL容量瓶中，按2.1.1中方法进行定容显色。在波长为510 nm处，每隔15 min测定一次吸光度。结果显示，芦丁与铝盐生成的络合物颜色在60 min内的变化很小，其吸光度的相对标准偏差(RSD)为1.304%，表明60 min内显色稳定性好。

2.1.3精密度试验精密吸取1 mL芦丁标准溶液，按照实验方法重复5次测吸光度，其结果的RSD为0.27%，表明测定方法的精密度良好。

2.1.4回收率试验精密吸取供试液0.5、0.6、0.8、1.0、1.5 mL然后分别加入芦丁标准品溶液0.5 mL，分别用水补充至6 mL，按照实验方法进行显色并测定其吸光值，每一个试样重复测定3次，取平均值，用回归方程计算总黄酮浓度，进而得出加标回收率分别为98.6%、98.93%、100.25%、100.41%、100.65%，均在95%～105%范围。

2.1.5总黄酮含量的测定精确吸取供试液1 mL，按照实验方法测定总黄酮含量，昆仑雪菊供试品中总黄酮含量为16.62%。

2.2 昆仑雪菊总黄酮的分离纯化工艺研究

2.2.1大孔吸附树脂筛选将选用的NKA-9、AB-8、D401、DO72、D301、D290、D110；HZ-816、HZ-806、HZ-818、D315型树脂按1.3.1和1.3.2中方法进行静态吸附和解吸实验，结果见表1。

表1 大孔树脂的筛选

由表1可以看出，AB-8、HZ-806、NKA-9、HZ-816、HZ-818 5大孔树脂的吸附率和解吸率高于其它树脂，D290型吸附树脂虽然吸附率很高，但解吸率非常低。AB-8型树脂的吸附率比NKA-9大孔吸附树脂高而HZ-806型树脂的吸附率比NKA-9大孔吸附树脂低，但是这两种树脂的解吸率均不如NKA-9大孔吸附树脂；HZ-816和HZ-818树脂虽然解析率与NKA-9大孔吸附树脂相近，但吸附率明显低于NKA-9大孔吸附树脂。综合考虑，选用NKA-9大孔吸附树脂进行纯化实验。

2.2.2吸附液pH值的确定黄酮类化合物为多羟基酚类，呈弱酸性，因而在弱酸性或酸性条件下易被吸附。由图1可知，当提取液的酸性越强,吸附后提取液的颜色变化很明显。吸附量随着提取液的pH值增大而增大，当提取液的pH=5时，吸附量最大，但是pH>5时，吸附量随着提取液的pH值增大反而下降，因此提取液的pH=5为最佳提取方案。

2.2.3洗脱剂乙醇浓度的确定分析图2的结果可知，当70%乙醇作为洗脱剂时解吸率最高，即解吸液中的黄酮含量最高。实验结果表明70%浓度的乙醇极性与提取液中黄酮的极性相似，故易于洗脱。

图1 溶液pH 值对吸附率的影响Fig.1 Effoct of pH on adsorption rate

图2 乙醇浓度对洗脱率的影响Fig.2 Effect of concentration of ethanol on rate elution

3 结论

吸附树脂用于昆仑雪菊总黄酮的分离,省去了传统溶剂萃取法的繁琐工艺,仅吸附→洗脱一步工艺即可得到高含量的昆仑雪菊总黄酮,而且收率高、成本低、操作简便,适于工业化规模生产。实验筛选出适用于昆仑雪菊黄酮分离纯化用的大孔吸附树脂 NKA-9，同时确定最佳吸附条件为：上柱液 pH 为5.0、洗脱剂乙醇浓度为70%。该方法为昆仑雪菊黄酮类物质的分离和鉴定提供了基础。