流动注射-化学发光法超灵敏测定甲基多巴

张 韫， 高苏亚

(西安医学院药学院，陕西西安 710021)

甲基多巴(Methyldopa)，化学名称为L-3-(3,4-二羟基苯基)-2-甲基丙氨酸，主要用于治疗中至重度原发性、肾性和恶性高血压[1]。文献已报道测定甲基多巴的方法有液相色谱法[2]、薄层色谱法[3]、分光光度法[4]、电化学法[5]、毛细管电泳法[6]、液质联用法[7]和核磁共振法[8]等。这些方法存在或灵敏度低，或操作复杂，或仪器昂贵、分析成本高等问题。因此，研究一种灵敏度高且简便快速的分析方法是十分必要的。

流动注射-化学发光法(Flow Injection-Chemiluminescence，FI-CL)具有灵敏度高、线性范围宽、试剂消耗量少和分析速度快等优点，在生物化学、药物分析及临床医学等领域具有广阔的应用前景。目前采用化学发光法测定甲基多巴的报道[9]较少。本实验基于甲基多巴对鲁米诺-肌红蛋白体系化学发光信号的抑制作用，建立了流动注射-化学发光超灵敏测定甲基多巴的新方法，并成功应用于生物流体中甲基多巴含量的测定。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

IFFM-E型流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈分析仪器有限责任公司)。

图1 流动注射-化学发光实验装置示意图Fig.1 Schematic diagram of the FI-CL system

鲁米诺(纯度≥97%,Sigma-Aldrich)储备液浓度为2.5×10-2mol/L；肌红蛋白(分子量17.2 kDa,Sigma-Aldrich)储备液浓度为5.0×10-5mol/L；甲基多巴(中国食品药品检定研究院)储备液浓度为1.0×10-4g/mL；以上储备液均于4 ℃保存。其它试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水，经艾柯KLZ-UV超纯水机(成都唐氏康宁科技发展有限公司)纯化。

1.2 实验方法

本实验装置由四条管路组成：鲁米诺(NaOH)、肌红蛋白、载液(超纯水)和甲基多巴样品溶液(图1)。泵流速为2.0 mL/min，待基线稳定，由六通阀定量注入的100 μL鲁米诺与肌红蛋白和甲基多巴样品液的混合液再混合后，在碱性条件下流入流通池。所产生的化学发光信号由光电倍增管(HV：-750 V)检测，再经IFFE-E型数据分析系统记录处理。

2 结果和讨论

2.1 实验条件的优化

实验对混合管长度以及溶液流速分别在9.0～19.0 cm和0.5～5.0 mL/min范围内进行了优化。综合考虑溶液混合效果及发光强度等因素，选定溶液流速为2.0 mL/min,混合管长度为10.0 cm。考察了鲁米诺溶液浓度在5.0×10-7～5.0×10-4mol/L范围内对体系化学发光信号的影响。当鲁米诺浓度为2.5×10-5mol/L时化学发光信号强而稳定，故以此浓度作为鲁米诺的实验浓度。

鲁米诺化学发光反应在pH为10～11条件下发光强度最大。因此在鲁米诺溶液中加入NaOH以提高化学发光反应的灵敏度。鲁米诺浓度为2.5×10-5mol/L时，对NaOH浓度在1.0×10-3～1.0×10-1mol/L范围内进行了优化实验。结果表明，NaOH浓度为2.5×10-2mol/L时鲁米诺化学发光体系的信号达到最大值，故实验选择NaOH的浓度为2.5×10-2mol/L。

研究表明肌红蛋白可以增敏鲁米诺体系的化学发光信号。考察了肌红蛋白在1.0×10-9～1.0×10-7mol/L范围内对体系发光信号的影响。实验发现随着肌红蛋白浓度的增大，发光信号相应增强，当浓度为1.0×10-8mol/L时发光信号趋于稳定。故选择肌红蛋白的实验浓度为1.0×10-8mol/L。

2.2 化学发光强度与反应时间的关系

图2 不同体系的化学发光强度-时间曲线Fig.2 CL intensity-time cuves of different systems1:luminol;2:luminol-myoglobin-methyldopa;3:luminol-myoglobin.

在流动注射系统中对鲁米诺-肌红蛋白-甲基多巴的化学发光行为进行了考察(图2)。实验中肌红蛋白、鲁米诺和NaOH浓度分别为1.0×10-8、2.5×10-5和2.5×10-2mol/L。由图2曲线1可知，鲁米诺体系在4.8 s(tmax)时发光强度达到最大值(Imax)124，且信号在18 s内消失；加入肌红蛋白后，体系的Imax增大至352，相应的tmax缩短为4.2 s(曲线3)。当1.0×102pg/mL甲基多巴存在时，Imax从352降至265，降低了25%，而tmax不变(曲线2)。

2.3 化学发光体系稳定性测试

对不同浓度甲基多巴存在下鲁米诺-肌红蛋白化学发光体系的稳定性进行了测试。将100 μL鲁米诺注入流动注射分析系统，记录化学发光信号来测试不同体系的稳定性。每个结果为7次进样测定的平均值。该实验持续3 d，系统每天运行8 h，结果显示，相对标准偏差(RSD)值均小于3.0%，可见该发光体系呈现良好的稳定性。

2.4 线性范围、检出限和相对标准偏差

实验发现鲁米诺-肌红蛋白体系化学发光信号降低值(△I=Io-Is，Io和Is分别为不存在和存在甲基多巴时体系的化学发光强度)与甲基多巴浓度(3.0～3.0×103pg/mL)的对数值存在良好的线性关系，线性方程为：△I=17.3lnc+3.47(c：pg/mL)，相关系数R=0.9965，检出限(3σ)为1.0 pg/mL。在流速2.0 mL/min条件下，完成一次测定(包括进样和冲洗管路)仅需36 s，采样频率达100/h。

2.5 干扰实验

2.6 样品分析

血清样品来源于陕西省人民医院，唾液和尿液样品由健康志愿者提供。实验采用标准加入法测定甲基多巴含量，结果分别列于表1、表2和表3，回收率为96.3%～104.1%，RSD均小于3.5%(n=7)。本法可成功用于人体唾液、尿液及血清中甲基多巴含量的测定。

表1 人体唾液中甲基多巴的含量测定(n=7)

表2 人体尿液中甲基多巴的含量测定(n=7)

表3 人体血清中甲基多巴的含量测定(n=7)

3 结论

本文以甲基多巴对鲁米诺-肌红蛋白体系化学发光的猝灭作用为基础，结合流动注射分析技术，建立了快速灵敏测定甲基多巴的新方法。本法具有灵敏度高、线性范围宽、分析速度快、试剂消耗少和仪器装置简单等优点，对生物流体中甲基多巴的分析测定及临床监测具有一定的意义。