蛹虫草虫草素提取工艺的研究

殷东林等

摘要：以蛹虫草[Cordyceps militaris（Linn. ）Link]子实体为材料，首先通过单因素分析法探索虫草素的最佳提取溶剂，结果表明，70%乙醇是虫草素的最佳提取溶剂，并通过正交试验考察了微波助提法中微波功率、微波时间、提取次数和料液比4个因素对虫草素提取功率的影响，最终建立了提取虫草素的最佳工艺条件，即微波功率350 W，微波处理时间4 min，提取2次，料液比1∶50（g∶mL），提取率可达6.87%。

关键词：蛹虫草[Cordyceps militaris（Linn. ）Link]；虫草素；正交试验；微波助提法

中图分类号：S567.3+3；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）18-4560-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.042

蛹虫草[Cordyceps militaris（Linn. ）Link]最早源于中国，俗称北虫草，由于其药用价值与冬虫夏草（Cordyceps sinensis）相似，故药典中亦记载为“北冬虫夏草”[1]。蛹虫草为子囊菌亚门，麦角菌目麦角菌科虫草属的模式种[2]，是国内外公认的食药用真菌，民间用于肺炎、肾虚、腰疼等疾病的治疗。其中所含的虫草多糖、虫草酸和虫草菌素（也称虫草素）均高于冬虫夏草，其独特药理作用已日益引起药学界的高度重视。

虫草素是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素，具有抗肿瘤、抑菌、抗病毒、免疫调节、抗炎[3]等非常广谱的生物学活性。早在1950年就有学者观察到被蛹虫草寄生的昆虫组织不易腐烂，进而从中分离出一种抗菌性物质，定名为虫草素。目前，以虫草素为主要成分的新药已试用于临床，有着良好的临床应用前景，但大量提取分离其纯品非常不易，化学合成也存在一定的弊端，因此国际市场上虫草素的价格非常昂贵。根据虫草素溶于水、热乙醇和甲醇的性质，虫草素的提取一般采用水、50%乙醇、乙醇和甲醇等溶剂。提取虫草素的方法有浸提法、回流法、渗漉法、超声波法、索氏提取法和超临界萃取等，不同的提取原料适用的方法不同。但为了进一步提高提取率和缩短提取时间，可用超声波辅助浸提[4]和微波辅助浸提，这2种方法操作简单且不易引入杂质。而微波透过提取溶剂到达物料内部使之快速升温，进而使其细胞内部压力增大，当压力超过细胞壁所能承受的能力时，细胞壁破裂，胞内有效成分流出，提取溶剂易于进入细胞内部，微波法要好于超声波法[5]，有效缩短了提取时间。

虫草素的紫外、红外光谱[6]、超导核磁共振法[7]可以用于虫草素的初步鉴定，而目前虫草素的分析测定多采用高效液相色谱（HPLC）[8]分析法，也有采用紫外分光光度法。HPLC虽然灵敏度高、重复性好、对流量和温度变化不敏感，但是成本高，一次性投资大。还有一种薄层色谱扫描法（TLCS）具有展开时间短、显色方便、价格较便宜的特点，但此法测定虫草素含量的准确度和精密度均略低于HPLC，因此有人综合HPLC与TLCS的优点，将两者结合起来对虫草素含量进行定性定量测定。本试验采用的是紫外分光光度法，结合单因素分析法和多因素正交分析法，对虫草素提取工艺进行优化，旨在为虫草素的提取提供一套简便、快捷、高效的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 无水乙醇、盐酸、蒸馏水

1.1.2 仪器 80目筛、电子天平（上海越平科学仪器有限公司）、数显恒温水浴锅（上海梅香仪器有限公司）、微波炉（佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司）、TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、循环水式多用真空泵、抽滤瓶、pH测定仪、RE52-86A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。

1.1.3 材料 蛹虫草子实体干燥后粉碎，过80目筛；虫草素标准品（上海金穗生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 虫草素的提取 用无水乙醇和蒸馏水按一定比例配制成20%、40%、50%、70%的乙醇；取干重2 g的蛹虫草粉，分别加入到已经调好的pH为5.0的100 mL蒸馏水、20%的乙醇、40%的乙醇、50%的乙醇、70%的乙醇、无水乙醇，70 ℃水浴20 min；然后用420 W微波辐射1 min，间隔1 min后再辐射1 min，如此间隔辐射直至总辐射时间达到4 min，然后转入70 ℃水浴提取30 min，用抽滤瓶抽滤提取液，4 ℃保存提取液用于检测。以上试验均做3次重复，取平均值。得到的提取液定容至50 mL即得到虫草素原始样品溶液，从每组样品液中准确吸取1 mL至500 mL容量瓶中并定容（即将原始样品溶液稀释500倍），用于测定其吸光度。

1.2.2 标准曲线的绘制 标准溶液的配制：准确称取虫草素标准品0.001 0 g，用50%的乙醇溶液定容于10 mL的容量瓶，准确量取上述储备液一定体积，用50%乙醇配制虫草素浓度均为2、4、6、8、10 μg/mL的标准溶液。紫外吸收光谱标准曲线的绘制：将浓度分别为2、4、6、8、10 μg/mL的虫草素溶液以蒸馏水作为参比，扫描200～350 nm紫外图谱，并测量259 nm处的吸光度，然后以虫草素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，每组做3次重复，取平均值。

1.2.3 样品含量的测定 准确量取已经过稀释的虫草素样品提取液于比色皿中，以蒸馏水为对照，在259 nm的波长处测定吸光度，将测得的吸光度带入标准曲线方程，从而计算出样品中虫草素的含量。虫草素提取率=测得虫草素的含量/蛹虫草粉末的质量×100%。

1.2.4 正交试验设计 确定了虫草素的最佳提取溶剂之后，用正交试验法L9（34）对微波助提法中的微波功率、微波时间、提取次数、料液比（g∶mL，下同）4个因素，分别取3个水平考察对虫草素提取率的影响，以确定最佳提取条件。L9（34）正交试验中因素与水平见表1。

2 结果与分析

2.1 标准曲线测定结果

以虫草素质量浓度对吸光度进行线性回归，得回归方程：Y=0.058 5X+0.019 6，R2=0.998 8，表明虫草素在质量浓度为2～10 μg/mL与吸光度呈良好的线性关系，标准曲线见图1。

2.2 最佳溶剂的确定

6组溶剂的提取率见图2。由图2可以看出，在本试验所用的6种溶剂中，70%乙醇的提取率最高，为4.15%，确定为虫草素的最佳提取溶剂。

2.3 正交试验结果

正交试验结果见表2。由表2可知，影响虫草素提取率的主次因素为微波功率﹥微波时间﹥提取次数﹥料液比，最优组合为A1B2C2D2，即微波功率350 W、微波处理时间4 min、提取2次、料液比1∶50，提取率可达6.87%。

3 小结

本研究以蛹虫草子实体为材料，研究了虫草素的提取工艺，通过单因素试验确定虫草素的最优提取溶剂为70%乙醇，该溶剂的提取率可达4.15%。通过正交试验考察了微波助提法中微波功率、微波时间、提取次数、料液比4个因素对虫草素提取率的影响，建立提取虫草素的最佳工艺条件为微波功率350 W、微波处理时间4 min、提取2次，料液比1∶50，提取率可达6.87%。由于蛹虫草中含有的成分复杂，热提取过程中单糖、水溶性蛋白质以及鞣质等一系列杂质也会被一并提出，为虫草素的纯化带来困难，试验所得的粗品中含有一定量蛋白质；另一方面，在试验过程中存在一些系统误差和偶然误差，因此会对试验结果产生一定程度的影响。虫草素的提取方法有很多，为了进一步提高提取率和缩短提取时间，本研究确定用微波助提法加以优化。微波能透过提取溶剂到达物料内部，使之快速升温，进而使其细胞内部压力增大。当压力超过细胞壁所能承受的能力时，细胞壁破裂，胞内有效成分易于流出，提取溶剂易于进入。但所用微波功率过大或处理时间过长可能会使有效成分分解，造成损失，故可通过正交试验确定最佳提取条件。微波辅助萃取技术具有快速、萃取率高、成本低、质量好等优点，是天然产物萃取中一种非常有发展潜力的新型技术。

参考文献：

[1] 江西新医学院.冬虫夏草中药大辞典（上册）[M].上海：上海人民出版社，1976.

[2] 王英娟，李多伟，王义潮，等.蛹虫草虫草素、虫草多糖综合提取工艺研究[J].西北植物学报，2005（15）：1863-1867.

[3] AN X R， KONG Y， WANG M C，et al.Artificial cultivation of cordycepin taishanensis on living larvas[J]. Edible Fungi of China，2007，166（1）：40-41.

[4] BU L， ZHU Z Y， LIANG Z Q，et al.Utilization of fungal elicitor in increasing cordycepin of Cordyceps militaris[J].Mycosystema，2002，21（2）：252-256.

[5] BEN S B，HUANG Z Q，WANG Y， et al. Optimizatiaon of selenium enrichment of Cordyceps militaris and analysis of the effects of selenium enrichment on contents of two major active components[J]. Food Science，2009，30（17）：266-269.

[6] 陈顺志.一种超临界萃取虫草脱氧核苷的生产方法[P].中国专利：CN 1339440. 2002-03-13.

[7] CHEN S Z，HU H，CHU J Z. A study of cordycepin discriminated by NMR[J]. Journal of Jin Zhou Medial College，1995， 16（4）：1-3.

[8] 温 鲁.提高蛹虫草培养物中虫草素含量的研究[J].江西农业科学，2005（6）：118-120.