FGFR2功能增强对小鼠下颌骨髁突发育影响

梁鑫，张波，刘苹，翁土军，张莉，贺龙珠，李芳菲，屈晨，王萍

1.重庆医科大学附属第一医院口腔科，重庆 400016；

2.第三军医大学大坪医院野战外科研究所第四研究室，重庆 400042

FGFR2功能增强对小鼠下颌骨髁突发育影响

梁鑫1，张波2，刘苹2，翁土军2，张莉2，贺龙珠1，李芳菲2，屈晨1，王萍1

1.重庆医科大学附属第一医院口腔科，重庆 400016；

2.第三军医大学大坪医院野战外科研究所第四研究室，重庆 400042

成纤维细胞生长因子受体2(Fibroblast growth factor receptor,FGFR2)是参与调控骨骼发育的重要分子，在调控软骨内成骨过程中发挥着重要作用。为了探讨FGFR2功能增强对小鼠下颌骨髁突生长发育的影响，文章以FGFR2功能增强型点突变(Fgfr2+/S252W)小鼠为研究对象，采用番红固绿染色研究Fgfr2+/S252W小鼠下颌骨髁突不同生长发育阶段的组织形态；利用免疫细胞化学染色和实时荧光定量PCR方法检测X型胶原(Col X)在3周龄小鼠髁突肥大软骨细胞中的表达。结果显示，1周龄、3周龄和6周龄突变型小鼠下颌骨髁突的软骨细胞层宽度都比同窝野生型窄，钙化软骨细胞层退化时间早，骨小梁钙化绿染程度深；Col X在突变型小鼠下颌骨髁突的表达高于同窝野生型小鼠(P<0.001)。结果表明，FGFR2功能增强可导致小鼠下颌骨髁突软骨层组织形态异常，抑制髁突软骨内成骨，从而导致下颌骨髁突发育畸形。

下颌骨；髁突；成纤维细胞生长因子受体2

下颌骨髁突的发育由软骨内成骨完成[1]。软骨内成骨受多种生长因子介导的信号通路调控，其中成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factors, FGFs)是参与软骨内成骨的重要分子[2]。FGFs需与其特异性的受体 FGFR(Fibroblast growth factor receptor)1~4[3]结合才能发挥功能。

Apert综合征(Apert syndrome,AS)是一种常见的人类颅缝早闭综合征，以冠状缝早闭、颅颌面部畸形、下颌反畸形、侏儒和并指/趾为典型体征。研究表明，AS主要由两种FGFR2功能增强型点突变，即Fgfr2 Ser252Trp或者Pro253Arg突变引起，其中 66%的 AS由 Fgfr2 Ser252Trp突变引起[4]。Fgfr2+/S252W小鼠为Fgfr2 Ser252Trp突变小鼠，该突变小鼠导致FGFR2与配体结合的范围扩大，从而使靶细胞的FGFR2功能持续增强[5]。

Fgfr2+/S252W突变小鼠有明显的颅颌面畸形，类似人类Apert综合征颅骨表型，即圆颅和短颅畸形，同时伴有严重的反畸形。Fgfr2+/S252W小鼠是研究AS患者下颌反畸形的良好动物模型[6]。本研究选用不同生长发育阶段的Fgfr2+/S252W小鼠为研究对象，通过对Fgfr2+/S252W小鼠及同窝野生型小鼠的下颌骨髁突进行组织学及分子生物学对比研究，探索FGFR2功能增强对下颌骨髁突发育的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

Fgfr2+/S252W-neo小鼠购自美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)。EIIA-Cre、C57BL/6J小鼠由解放军第三军医大学大坪医院实验动物中心提供。Fgfr2+/S252W小鼠由Fgfr2+/S252W-neo小鼠和EIIA-Cre小鼠交配后获得。所有小鼠遗传背景皆为C57BL/6J；所有小鼠均为SPF级。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

小鼠基因型鉴定及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)所需引物由上海生工生物工程技术股份有限公司合成。引物序列见表1。

1.2.2 Fgfr2+/S252W模型小鼠的保种繁殖

Fgfr2+/S252W-neo小鼠和EIIA-Cre小鼠进行交配，子代将获得约1/4数量的Fgfr2+/S252W小鼠，通过基因型鉴定明确为Fgfr2+/S252W突变小鼠后进行后续实验。Fgfr2+/S252W-neo小鼠和 EIIA-Cre小鼠分别与C57BL/6J野生型小鼠交配得以繁殖[7]。

表1 小鼠基因型鉴定及qRT-PCR引物序列

1.2.3 小鼠基因型鉴定

分别剪取出生10 d的EIIA-Cre、Fgfr2+/S252W-neo、Fgfr2+/S252W小鼠脚趾，经组织提取获得各自的基因组DNA。分别对Cre基因、neo基因、Fgfr2+/S252W小鼠基因组的突变位点进行PCR扩增。PCR扩增体系(PCR Amplification Kit(R011),TaKaRa)包括：2×PCR mix 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，DNA 1 μL，超纯水补足体积20 μL。扩增条件：94℃预变性4 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环；72℃延伸10 min。扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶自动成像仪记录电泳图谱。

1.2.4 番红固绿染色

选取1周龄、3周龄和6周龄Fgfr2+/S252W小鼠及同窝对照野生型小鼠各3只，取右侧下颌骨固定、脱钙、酒精梯度脱水、二甲苯透明、包埋、切片。常规石蜡切片脱蜡、复水，番红O(Sigma,USA)染色，流水冲洗，固绿(上海生工生物工程技术股份有限公司)染色，冰醋酸快速漂洗，流水冲洗，常规脱水、透明、封片，光学显微镜下观察。

1.2.5 免疫细胞化学染色

选取3周龄Fgfr2+/S252W小鼠及同窝对照野生型小鼠各5只，取右侧下颌骨固定、脱钙、脱水、透明、包埋、切片。常规石蜡切片脱蜡、复水，参照试剂盒说明书(SP9001，北京中杉金桥生物技术有限公司)SP法进行抗 Col X(Rabbit polyclonal against mouse(ab58632)，Abcam)免疫细胞化学染色，DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明、封片，光学显微镜下观察。

1.2.6 实时荧光定量PCR检测基因表达

选取3周龄Fgfr2+/S252W小鼠及同窝对照野生型小鼠各5只，解剖显微镜下分离得到小鼠右侧下颌骨髁突软骨层，提取总RNA(TRIzol,Invotrogen)，逆转录成cDNA，检测软骨晚期标志基因Col X表达情况。PCR扩增体系：2×master mix 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，cDNA2 μL，ROX 0.2 μL，ddH2O 7 μL(SYBR®Premix Ex Taq™II(RR820A), TaKaRa)。扩增条件：95℃预变性30 s；95℃ 5 s，57℃ 30 s，40个循环；95℃ 15 s，57℃ 30 s至95℃15 s连续扫描，0.2℃/s进行溶解曲线分析。以内参基因(GAPDH)进行校正。每次做3个复孔，每个基因重复3次。

1.2.7 统计学处理

Col X免疫细胞化学染色阳性细胞的积分光密度值(IOD)及mRNA表达结果以均值±标准差()表示，采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，对两样本均数比较采用成组t检验方法。P<0.05为有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 PCR产物电泳鉴定结果

图1 小鼠基因型鉴定电泳图A：EIIA-cre小鼠基因型鉴定结果(481 bp)，无条带为野生型小鼠；B：Fgfr2+/S252W-neo小鼠基因型鉴定结果(400 bp)，无条带为野生型小鼠；C：Fgfr2+/S252W小鼠基因型鉴定结果(520 bp/460 bp)，无条带及单条带者皆为野生型小鼠。MT：Fgfr2+/S252W小鼠；WT：野生型小鼠。

电泳结果显示：位于481 bp处有单一条带鉴定为EIIA-Cre小鼠，无条带的为野生型小鼠(图1A)；位于400 bp处有单一条带鉴定为Fgfr2+/S252W-neo小鼠，无条带的为野生型小鼠(图1B)；位于460 bp处和520 bp处出现双条带鉴定为Fgfr2+/S252W小鼠，无条带及单条带的为野生型小鼠(图1C)。

2.2 Fgfr2+/S252W小鼠颅颌面观察

与同窝野生型小鼠相比，Fgfr2+/S252W小鼠有明显的反牙合畸形，下颌过度前伸，上下颌咬合关系异常；同窝野生型小鼠表现为正常的咬合关系(图2)。

2.3 Fgfr2+/S252W小鼠髁突组织学观察

出生早期(1周龄)(图3：A，B)，野生型小鼠下颌骨髁突软骨分层清楚，排列有序，从表面纤维层到肥大软骨细胞层可见细胞由扁平逐渐向椭圆形、圆形过渡，大而圆的肥大软骨细胞整齐排列于软骨下骨化中心上方。Fgfr2+/S252W小鼠下颌骨髁突软骨细胞分层清楚，但各层细胞排列不整齐，特别是肥大软骨细胞层和钙化软骨细胞层，软骨层厚度较野生型小鼠窄。Fgfr2+/S252W小鼠的肥大软骨细胞大小不一，部分细胞可见细胞核消失，与钙化软骨细胞层界限不清；钙化软骨细胞层软骨基质已部分钙化绿染，且染色程度较野生型小鼠深。小鼠生长发育中期(3周龄)(图3：C，D)，Fgfr2+/S252W小鼠髁突软骨细胞层厚度较野生型小鼠明显变薄，钙化软骨细胞层仅部分残留，髁突软骨下骨化中心骨小梁结构较野生型更粗壮成熟。小鼠生长发育晚期(6周龄)(图3：E，F)，可明显观察到Fgfr2+/S252W小鼠软骨细胞层更窄，增殖层和肥大层软骨细胞数量明显减少，而钙化软骨细胞层已完全被骨组织替代，骨小梁形态粗壮成熟。

图2 突变型小鼠(MT(Fgfr2+/S252W))和同窝对照野生型小鼠(WT)颅颌面观察左侧突变型小鼠上下颌咬合关系异常，而右侧野生型小鼠上下颌咬合关系正常。黑色箭头指向上切牙。

2.4 免疫组化检测Fgfr2+/S252W小鼠髁突Col X表达

采用Image-pro Plus 6.0图像分析软件对3周龄Fgfr2+/S252W小鼠和野生型小鼠髁突表达Col X的阳性细胞进行积分光密度值(IOD)分析，结果表明Fgfr2+/S252W小鼠Col X的表达明显高于野生型小鼠(P<0.001)(图4：A，B，C)。

2.5 Fgfr2+/S252W小鼠髁突Col X mRNA的表达

3周龄Fgfr2+/S252W小鼠下颌骨髁突Col X mRNA的表达较野生型小鼠明显上调(P<0.001)(图4：D)。

3 讨 论

下颌骨髁突发育由软骨内成骨完成[1]。全身骨骼除了颅骨和锁骨等扁骨外，其他大部分的骨骼都是通过软骨内成骨发育形成。在这种成骨方式中，间充质细胞分化为软骨细胞，然后软骨细胞增殖、分化并有序排列形成生长板，最后软骨组织被骨组织替代形成骨骼[8]。其中生长板软骨细胞的分化从静息软骨细胞开始，逐渐分化为增殖软骨细胞，最后分化为肥大软骨细胞[9]。

髁突软骨是覆盖于下颌骨髁突表面的一层结缔组织，由纤维软骨组成。髁突软骨有其特有的“层域化”结构[10]，各层界限分明，从外到里依次为：表面纤维层，增殖浅层，增殖深层，肥大软骨细胞层，钙化软骨细胞层。增殖层细胞具有增殖分化功能，是髁突生长发育的细胞来源；肥大软骨细胞是软骨内成骨过程中最为活跃的细胞，是调节骨生长的重要细胞；它是终末软骨细胞，可以诱导血管生成、调节软骨基质的钙化、最终引导骨组织生成[9]。X型胶原(Col X)是肥大软骨细胞特异性合成的胶原，是肥大软骨细胞特有的标志蛋白，在软骨内成骨过程中发挥着重要作用[11]。髁突软骨细胞层对颞下颌关节的发育及咬合关系的建立有着重要影响。

图3 突变型小鼠(MT(Fgfr2+/S252W))和同窝对照野生型小鼠(WT)髁突番红固绿染色A,C,E：突变型小鼠髁突组织切片；B,D,F；野生型小鼠髁突组织切片。A,B：1周龄小鼠；C,D：3周龄小鼠；E,F：6周龄小鼠。放大倍数：×400；bar：20µm。

图4 突变型小鼠(MT(Fgfr2+/S252W))和同窝对照野生型小鼠(WT)髁突Col X的表达A：3周龄突变型小鼠髁突Col X免疫细胞化学染色；B：3周龄野生型小鼠髁突Col X免疫细胞化学染色；C：3周龄突变型和野生型小鼠髁突Col X阳性细胞的积分光密度值(IOD)统计(n=5)；D：3周龄突变型和野生型小鼠髁突Col X mRNA的表达(n=3)。放大倍数：×400；bar：20µm；***：P<0.001。

近年来大量研究发现FGF信号与骨骼发育及疾病有密切关系，其中FGFR1-3突变可导致颅缝早闭、颅颌面畸形、软骨发育不良等人类骨骼发育疾病[12]。Yasuda等[13]报道Fgfr3 P244R点突变可导致颞下颌关节髁突发育缺陷。Fgfr2不同位点突变可导致各种遗传疾病，如Apert综合征(AS)[4]、Crouzon综合征(CS)[14]和Pfeiffer综合征(PS)[15]等，患者颌面部均表现出明显的反牙合畸形。因此FGFR2/FGFs信号通路在调控下颌骨髁突发育中有着至关重要的作用。本文分别对Fgfr2+/S252W小鼠和野生型小鼠3个不同生长阶段的下颌骨髁突进行组织学研究，Fgfr2+/S252W小鼠髁突软骨细胞层厚度窄于野生型小鼠，表明FGFR2功能增强可使小鼠髁突软骨细胞生长受到抑制。Fgfr2+/S252W小鼠髁突钙化软骨细胞层较同发育时期的野生型小鼠更早退化，髁突骨小梁较野生型小鼠更早形成，由此可见，FGFR2功能增强可导致小鼠髁突生长发育周期变短。同时Fgfr2+/S252W小鼠髁突Col X的表达高于野生型小鼠，表明FGFR2功能增强型小鼠的肥大软骨细胞活性强于野生型小鼠，髁突软骨组织更快骨化。

综上所述，FGFR2功能增强可抑制髁突各层软骨细胞增生，并活化肥大软骨细胞，导致髁突软骨下骨化中心的骨小梁提早骨化，较野生型小鼠更早停止生长发育，从而使Fgfr2+/S252W小鼠的下颌骨髁突发育异常，呈现出反畸形。有关FGFR2/FGFs信号通路对下颌骨髁突发育影响的具体调控机制将在后续实验中进一步研究。

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(责任编委:吴强)

Again-of-function mutation in FGFR2 influences mandibular condylar development on mice

Xin Liang1,Bo Zhang2,Ping Liu2,Tujun Weng2,Li Zhang2,Longzhu He1,Fangfei Li2, Chen Qu1,Ping Wang1

1.Department of Stomatology,First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;
2.Department 4,Daping Hospital,Research Institute of Surgery,Third Military Medical University,Chongqing 400042,China

The development of the skeleton is regulated by numerous signaling molecules expressed in epiphyseal cartilage controlling both chondrogenesis and osteogenesis such as fibroblast growth factor receptors (FGFRs).In order to explore the important effect of fibroblast growth factor receptor 2(FGFR2)in the process of mandibular condylar growth,we introduced gain-of-function Fgfr2+/S252Wmice,and investigated mandibular condylar morphology by means of safranin-o/fast green staining at the stage of 1 week,3 weeks and 6 weeks.The mutant mice displayed narrower width of the mandibular condylar growth plate,stronger stainings of trabecular bone at the stage of 1 week,3 weeks and 6 weeks and faster degradation of the calcified cartilage cell layer at the stage of 6 weeks.We also assessed the expression of type X collagen(Col X)in mandibular condyle at the stage of 3 weeks by immunohistochemical staining and real-time PCR.The results showed that Col X was increased in the mutant mice. In conclusion,the gain-of-function mutation in FGFR2 resulted in histopathological abnormalities and development deformity of mandibular condyle cartilage in mice,which inhibited endochondral bone formation.

mandibular;condyle;fibroblast growth factor receptor 2

2014-10-28;

2015-01-20

国家重点基础研究发展规划项目(973计划)(编号：2011CB964701)资助

梁鑫，硕士，专业方向：口腔内科学。E-mail:654066262@qq.com

王萍，博士，教授，研究方向：牙髓根尖周病、口腔颅颌面组织生长发育研究。E-mail:cqcnwp@sina.com

10.16288/j.yczz.14-370

时间:2015-3-11 9:18:41

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150311.0918.002.html