转基因大豆GTS40-3-2环介导等温扩增检测方法的建立

杨丽霞，邱华丽，彭新凯，宋涛平

（长沙市食品质量安全监督检测中心，湖南 长沙 410013）

转基因大豆GTS40-3-2环介导等温扩增检测方法的建立

杨丽霞，邱华丽，彭新凯，宋涛平

（长沙市食品质量安全监督检测中心，湖南 长沙 410013）

采用转基因大豆GTS40-3-2品系特异性基因LAMP引物，建立2种转基因大豆GTS40-3-2品系特异性基因等温扩增方法：（1）实时荧光环介导等温扩增方法；（2）反应前加入染料羟基萘酚蓝（HNB）作为LAMP扩增的指示剂，根据反应后HNB的颜色变化进行判定。对两种方法进行灵敏度、特异性测试，结果表明，两种方法皆能快速、特异性检测出转基因大豆GTS40-3-2品系成分，定性检测限为0.1%。基于颜色判定的LAMP检测方法对设备要求更简单，更适用于日常检验及监管部门进行转基因成分的快速检测。

转基因大豆GTS40-3-2品系；环介导等温扩增；可视化检测

自1993年第一个商品化的转基因延迟成熟西红柿在美国成功上市以来，转基因作物的种植面积不断扩大，由1996年的170万hm2增长至2011年的1.6亿hm2，增长了94倍。转基因作物商业化发展迅速。种植面积最大的转基因作物为抗除草剂大豆，达6920万hm2，占全球大豆种植面积的67%［1］。

对于转基因食品的标识管理，欧盟对转基因成分的最低限量规定为0.9%，日本、澳大利亚、新西兰对转基因成分的最低含量做了不同规定，阈值从1%至5%不等。2002年，我国农业部发布的《农业转基因生物标识管理办法》规定，转基因食品需强制进行转基因标识［2］。对转基因产品的定性或定量检测是贯彻标识制度的重要前提。

普通PCR和荧光定量PCR是转基因检测最常用的方法，但这些方法对设备和技术的要求较高。环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi等［3］于2000年研发的一种新颖的恒温基因扩增方法，具有操作简便、对仪器设备要求低、灵敏度高、特异性强、快速、准确等优点。LAMP扩增反应已应用于转基因大豆［4］、转基因玉米［5］和转基因水稻［6］检测。本文将普通LAMP与实时荧光扩增技术相结合，建立了实时荧光LAMP技术，可实时监测目的基因扩增情况；同时，应用金属离子指示剂羟基萘酚蓝（hydroxy naphthol blue， HNB）判定反应结果［7］，使LAMP的结果判断更简单直观，提供了一种转基因大豆GTS40-3-2品系可视化快速检测方法。

1　材料与方法

1.1材料

转基因大豆标准品：GTS40-3-2（1%），购自北京北化恒信生物技术有限公司；进口商品：大豆、大豆蛋白，河南省出入境检验检疫局江志毅老师馈赠；样品：豆浆、豆腐样品和有机大豆购自超市，2份河南大豆样品、2份湖南大豆样品。

1.2主要试剂仪器

1.2.1试剂DNA等温扩增试剂盒：广州迪澳生物科技有限公司；羟基萘酚蓝（HNB）购自美国 Sigma公司；100 bp DNA ladder、Premix TaqTM购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2.2仪器超微量核酸蛋白分析仪：BD1000，北京五洲东方科技发展有限公司；PCR仪：Bio-rad PCR

扩增仪；实时荧光定量PCR仪：7500 FAST，美国应用生物系统公司。

1.3DNA提取

转基因大豆DNA和样品DNA提取参照DNA抽提试剂盒［宝生物工程（大连）有限公司］的操作步骤。

表1　引物序列Table 1　Sequences of primers

1.4引物序列

转基因大豆 GTS40-3-2品系特异性基因LAMP引物参照Zhang等［8］，序列见表1，由上海生工生物工程公司合成，HPLC纯化。

1.5特异性分析

以转基因大豆、非转基因大豆、转基因玉米Mon863、水稻TT51-1等样品DNA为模板进行扩增，确定引物的特异性。25 μL LAMP 反应体系：外引物（GTS-F3/GTS-B3） 0.2 μmol·L-1，内引物（GTS-FIP /GTS-BIP） 1.6 μmol·L-1，环引物（GTS-LB/GTS-LF） 0.3 μmol·L-1，8 U Bst DNA聚合酶1 μL、2×反应缓冲液12.5 μL及100 ng·μL-1DNA模板1 μL。反应条件：63 ℃，45 min；80 ℃，10 min。实时荧光LAMP法加SYTO-9荧光染料0.5 μL，在实时荧光定量PCR仪上完成反应；显色法加3 mmol·L-1HNB 0.5 μL，在普通PCR仪上完成反应。

1.6灵敏度分析

将1% GTS40-3-2大豆粉与非转基因大豆粉按比例混合，使转基因大豆GTS40-3-2占总重的1%、0.5%、0.1%和0，用试剂盒提取基因组后，浓度调整为100 ng·μL-1。进行实时荧光LAMP扩增时，每个浓度设置2个平行，用实时荧光定量PCR仪进行监测。普通LAMP扩增后，通过观察反应管中液体颜色，验证扩增反应是否发生，如发生扩增，溶液为天蓝色，否则溶液为紫罗兰色。

常规PCR采用Premix TaqTM，用引物（GTS-F3/GTS-B3）对不同浓度梯度的转基因大豆基因组DNA模板进行扩增，该对引物可扩增出214 bp核酸片段。常规PCR反应体系：2×Premix Taq 12.5 μL，0.5 μL上游引物GTS-F3（10 μmol·L-1），0.5 μL下游引物GTS-B3（10 μmol·L-1），100 ng DNA 模板，补灭菌蒸馏水至25 μL。反应程序为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s共进行35个循环；最后72 ℃10 min。

1.7实际样品检测

利用建立的2种LAMP方法对9份样品进行检测，同时采用普通PCR检测，比较三种方法检测效果。

2　结果与分析

2.1特异性试验

以非转基因大豆、转基因玉米Mon863、水稻TT51-1等样品DNA为模板进行扩增，确定实时荧光LAMP法检测转基因大豆GTS40-3-2的特异性。实时荧光LAMP法扩增曲线见图1： A，结果显示反应中仅转基因大豆GTS40-3-2的DNA模板有扩增曲线，LAMP显色法结果见图1： B，仅转基因大豆溶液呈现天蓝色，表示为阳性，两种反应的结果一致，说明引物的特异性好。

2.2灵敏度试验

用1%、0.5%、0.1%、0转基因大豆GTS40-3-2样品DNA进行灵敏度实验，实时荧光LAMP扩增图谱见图2： A，LAMP显色法结果见图2： B。灵敏度试验表明，实时荧光LAMP法和LAMP显色法的检测低限均可达0.1%。

图1　转基因大豆LAMP特异性Fig. 1　LAMP specific amplification pattern of transgenic soybean

图2　转基因大豆LAMP灵敏度Fig. 2　LAMP sensitivity of GTS40-3-2

图3　转基因大豆普通PCR灵敏度Fig. 3　PCR sensitivity of GTS40-3-2

图3为普通PCR灵敏度检测结果，根据引物的设计，扩增的目的基因为214 bp，通过电泳图可看出含量低至0.1%的转基因大豆GTS40-3-2成分样品也可检测到。

2.3实际样品检测

实际样品检测结果见表2。LAMP法与普通PCR的检测结果完全一致，表明本文建立的LAMP法检测转基因大豆品系检测性能，不仅可用于大豆的检测，也可用于大豆制品的检测。

3　讨论

表2　实际样品检测结果Table 2　Results of samples

本研究选取转基因大豆GTS40-3-2外源插入序列的3′端设计引物，建立的转基因大豆GTS40-3-2品系特异性基因实时荧光LAMP和LAMP显色检测方法，与非转基因大豆、转基因玉米、水稻等均没有出现交叉反应，表明引物特异性好。这2种方法的灵敏度与普通PCR均可达到0.1%，而刘津等［9］报道的转基因大豆GTS-40-3-2显色法的灵敏度为0.5%，故本研究建立的实时荧光LAMP法和显色法比以前建立的显色法灵敏度有所提高，能够满足检测要求。本研究采用的商业化恒温扩增试剂盒，其优化的反应缓冲液可能有助于提高反应的灵敏度。

实时荧光LAMP法利用双链DNA结合荧光染料后产生荧光信号的特性，实现扩增产物与荧光信号收集同步，样品的扩增结果可通过荧光信号直接读取，不需要通过电泳、染色及浊度法进行判定。目前，该技术已成功应用于间日疟原虫［10］、疟疾［11］、鲍曼不动杆菌［12］、副溶血性弧菌［13］、金黄色葡萄球菌［14］和猪肉成分［15］的检测。实时荧光LAMP法可实时监控反应过程，而且可以根据曲线的特征判定引物二聚体及反应扩增效率，能够加快LAMP引物筛选及扩增条件优化过程。本文采用的荧光染料SYTO-9，是一种比SYBR Green更适合实时荧光LAMP的染料，因为其基线荧光较低，区分度更好［11］。

LAMP显色法反应结果可用肉眼直观判断，常用的染料有SYBR GreenⅠ和HNB等。高浓度SYBR GreenⅠ染料抑制LAMP反应，必须反应后加入，容易造成气溶胶污染；低浓度SYBR GreenⅠ染料对LAMP反应无干扰，但必须在实时荧光检测仪上反应，显示扩增结果。HNB可以在反应前加入且对反应无干扰。本研究使用HNB指示剂建立的LAMP显色法，阴性、阳性结果差别明显，易于判断，灵敏度与实时荧光LAMP法相同，表明基于HNB的LAMP显色法结果可信。该方法无需开盖操作，灵敏度又高，避免了气溶胶污染，而且只要有水浴锅即可进行检测，无需特殊仪器设备，具有便携、灵敏、特异性高等优点，在短时间内能完成检测，更适用于基层和进出口岸进行快速检验。

［1］ 蒋亦武，黄明，王保战，杭宝建，何健，李顺鹏. 转基因大豆及制品中转基因成分检测技术研究进展［J］. 江苏农业科学，2011（1）： 345—348.

［2］ 农业部农业转基因生物安全管理办公室. 农业转基因生物标识管理办法［EB/OL］. 2010-07-17［2010-11-12］http：//www.moa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/zcfg/201007t20100717_1601302.htm.

［3］ Notomi T， Okayama H， Masubuchi H， Yonekawa T， Watanabe K， Amino N， Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA［J］. Nucleic Acids Research， 2000，28（12）： E63.

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Establishment of Loop-mediated Isothermal Amplification Method for Detection of Transgenic Soybean GTS40-3-2 Strain

YANG Li-xia， QIU Hua-li， PENG Xin-kai， SONG Tao-ping
（Changsha Center of Supervision & Inspection on Food Quality Safety， Changsha 410013， Hunan China）

According to the specific loop-mediated isothermal amplification （LAMP） primers， two specific LAMP methods for the detection of the transgenic soybean GTS40-3-2 strain were established： （1） real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification （RT-LAMP）； （2）LAMP with hydroxy naphthol blue （HNB） dye as indicator. The specificity and sensitivity of these two methods were evaluated. The results indicated that the transgenic soybean GTS40-3-2 could be distinguished from several GM events and non-GM plants with limitation of dection of 0.1%. The LAMP assay with HNB dye requires only simple laboratory equipment and it is suitable for daily inspection and supervision departments for rapid detection of genetically modified ingredients.

transgenic soybean GTS40-3-2 strain； loop-mediated isothermal amplification； visual detection

10.3969/j.issn.1009-7791.2015.03.007

S565.1

A

1009-7791（2015）03-0213-05

2015-05-17

湖南省质量技术监督局科研项目（2013KJJH11）

杨丽霞，博士，高级工程师，从事食品安全分子生物学研究。E-mail： yanglixia612@163.com