白色类诺卡氏菌的分离鉴定及其抗菌活性初探

雒晓芳，陈俊楠，田丹妮，汪如婷，马麟龙，莫芳芳

（1.西北民族大学实验中心，甘肃兰州730030；2.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030）

白色类诺卡氏菌的分离鉴定及其抗菌活性初探

雒晓芳1，陈俊楠2，田丹妮2，汪如婷2，马麟龙2，莫芳芳2

（1.西北民族大学实验中心，甘肃兰州730030；2.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030）

该研究对白色类诺卡氏菌（Nocardioides albus）进行分离鉴定，并通过温度、紫外、酸碱处理，以绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、暗黑微绿链霉菌（Streptomyces atrovirens）为指示菌，用琼脂打孔法进行抑菌实验；用药敏片法进行药敏实验，初步探讨分离菌株的药物敏感性以及抑菌性。结果表明，紫外作用30 min及温度对其抑菌性影响不大；强酸、强碱环境中白色类诺卡氏菌基本没有抑菌活性。白色类诺卡氏菌对抗生素较为敏感，药敏性较高。

白色类诺卡氏菌；分离鉴定；抑菌活性；药敏性

放线菌（Actinomycete）是微生物的一类菌群，存在极大的经济、使用价值，其产生的抗生素和次生代谢产物在农业方面、医疗方面有重大作用［1］。放线菌是产生抗生素活性物质最多的一类微生物，迄今已知的抗生素中，有2/3是由放线菌产生的。利用链霉菌（Streptomyces）［2］产生的抗病菌活性物质对植物病害进行生物防治，则具有周期短、易于研究、便于生产、无毒无害等优点［3］。从天然资源中寻找活性物质代替化学农药和使用天然抗菌化合物保护作物已成为当前研究的重点［4-5］。

放线菌中的白色类诺卡氏菌（Nocardioides albus）生活在自然界的各种环境中，以孢子或菌丝的状态存在。不论数量和种类，以土壤中最多。成万上百万的孢子聚集生活在一克土壤中；但是由于土质、气候等条件的影响，一般情况下，肥沃的土壤中白色类诺卡氏菌多，偏酸性土中的菌株比中碱性土中的菌株含量少。白色类诺卡氏菌的菌落组成是菌丝体，一般圆形、光平或有许多皱褶。白色类诺卡氏菌产生的抗生素中90%是链霉菌产生。常见的链霉素（streptomycin）、土霉素（oxytetracycline）、丝裂霉素（mitomycin）；医学上抗肿瘤的博莱霉素（bleomycin）、抗结核的卡那霉素（kanamycin）；抗真菌的制霉菌素以及井冈霉素（validamycin）等，都是链霉菌的次生代谢产物。此外诺卡氏菌是目前已分离鉴定的烷烃降解菌之一［4］，诺卡氏菌属（Nocardia）能利用石油中的烷烃为碳源，从而降解石油。虽然有从石油污染土壤中分离出高效降解的菌株的研究［5］，但是，有关白色类诺卡氏菌的研究却很少见［6-10］，因此，本研究对筛选出的这株白色类诺卡氏菌进行了初步鉴定，并探索其抑菌活性及药敏性，为进一步治理石油污染奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌株来源

白色类诺卡氏菌（Nocardioides albus，Na）是由本校实验室以甘肃陇东地区西峰市油田附近的含油土壤为菌源，用原油作为唯一碳源进行平板划线筛选分离得到。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida，Pp）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，Bs）、暗黑微绿链霉菌（Streptomyces atrovirens，Sa）这4株指示菌均由西北民族大学实验中心微生物实验室提供。

1.1.2抗生素药敏片

四环素、头孢曲松、丁胺卡那霉素、先锋霉素Ⅵ、卡那霉素、麦迪霉素、氯霉素、先锋霉素Ⅳ、新霉素、万古霉素、强力霉素、先锋霉素Ⅴ等药敏片均由均由西北民族大学实验中心微生物实验室提供。

1.1.3培养基

无机盐培养基：NaNO32 g/L，K2HPO40.5 g/L，KH2PO41g/L，无水MgSO40.05g/L，无水CaCl20.01g/L，NaCl0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，pH 7.2，石油5 g/L，121℃高压蒸汽灭菌20 min。

原油油培养基：无机盐培养基500 mL，原油3 g，若需要配制固体培养基应另加入琼脂10 g，121℃高压蒸汽灭菌20 min。

营养肉汤培养基：营养肉汤18 g/L，琼脂15 g/L，121℃高压蒸汽灭菌20 min。

斜面保存培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1 g，氯化钠0.5 g，琼脂2 g，蒸馏水100 mL，pH 7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.2仪器与设备

SSW-CJ-ZF超净工作台、HH.B11.600-BS-Ⅱ电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂；ZWY-200D多振幅轨道式恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；HVE-50全自动高压灭菌器：日本Hirayama公司；DHP-9162电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；ES-300E电子天平：长沙湘平科技发展有限公司。

1.3方法

1.3.1白色类诺卡氏菌的分离筛选

取5 g含油土壤加入有400 mL无机盐培养基的1 L的三角烧瓶中，于30℃、180 r/min的恒温振荡条件下培养，7 d后取10 mL培养液转接至新的原油培养基，相同环境培养7 d，重复此富集培养操作3次。

在无菌的环境下用接种环蘸取富集培养液，在原油平板上常规划线后，平板于28℃恒温培养箱中倒置培养48～72 h，然后将生长较好的形态不同的单个菌落在原油培养基上进行纯化，做平板划线分离，纯化。将纯化的菌株在固体无机盐培养基上划线，再向无机培养基中加入原油，使原油保持为0.5%的含量，于30℃温箱中培养，选出在原油平板上生长较快的菌株，以牛肉膏蛋白胨纯化并用牛肉膏蛋白胨斜面保存，置于4℃冰箱备用。

1.3.2白色类诺卡氏菌的鉴定

根据《常见形态观察和生理生化特性指标的测定细菌系统鉴定手册》［11］和《放线菌系统学原理、方法及实践》［12］中所列各项实验内容进行检测。

1.3.3抑菌实验准备

将冰箱保存的白色类诺卡氏菌株接种到含有30 mL营养肉汤液体培养基的50 mL锥形瓶中，30℃、130 r/min恒温振荡培养48 h。Sa菌株接种到含有30 mL营养肉汤液体培养基的50 mL锥形瓶中，30℃、130 r/min恒温振荡培养48 h。Pa、Pp、Bs分别接种到含有30 mL营养肉汤液体培养基的50mL锥形瓶中，37℃恒温培养48h。将活化好的Pa、Pp、Bs、Sa稀释至10-2，待用。分别配制1mol/LHCl和1mol/L NaOH溶液100 mL，待用。

1.3.4抑菌试验

（1）白色类诺卡氏菌株对紫外线的稳定性

将活化的白色类诺卡氏菌置于紫外光下照射30 min。待用。

实验组（A）：无菌环境下取12个无菌培养皿，分为4组，每组3个重复。倒入营养肉汤固体培养基制成平板。待培养基冷却后，每组的平皿分别加入100 μL稀释好的Pa、Pp、Bs、Sa菌液，用涂布棒涂布均匀，放置10 min。用灭好菌的打孔器在培养基上打孔7个，孔要分布均匀。每组分别加入适量白色类诺卡氏菌（紫外处理）。静置1 h后放入恒温培养箱中28℃培养12～24 h；测量抑菌圈的直径，观察抑菌圈边缘整齐度。

对照组（CK）：无菌环境下取4个无菌培养皿。倒入营养肉汤固体培养基制成平板。待培养基冷却后，每组的平皿分别加入100 μL稀释好的Pa、Pp、Bs、Sa菌液，用涂布棒涂布均匀，放置10 min。用灭好菌的打孔器在培养基上打孔7个，孔要分布均匀。每组分别加入适量白色类诺卡氏菌。静置1 h后放入恒温培养箱中28℃培养12～24 h，测量抑菌圈直径。

（2）白色类诺卡氏菌对温度的稳定性

取2份活化的白色类诺卡氏菌分别放于28℃和55℃水浴锅中处理30 min，再按1.3.4步骤操作并测量抑菌圈直径。

（3）白色类诺卡氏菌对酸碱的稳定性

取2份活化的白色类诺卡氏菌分别用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液调节pH值为4、10，室温条件下静置1 h，再将各处理恢复至pH 7，等体积比稀释白色类诺卡氏菌，再按1.3.4步骤操作并测量抑菌圈直径。

1.3.5药敏试验

取6个无菌培养皿倒入营养肉汤固体培养基制成平板，分为2组，每组3个重复。培养基冷却后，每个平板加入300 μL白色类诺卡氏菌，涂布均匀，放置10 min。用灭好菌的镊子将药敏片紧贴在培养基上，静置15 min，再放入37℃电热恒温培养箱培养12～24 h，测量抑菌圈直径。（注意：药敏片间距离＞28 mm，距离平板边缘＞16 mm。）

2　结果与分析

2.1白色类诺卡氏菌的初步筛选

本实验所用的白色类诺卡氏菌是从油田受污染土样中，以石油为唯一碳源分离筛选得到的。菌株培养2 d后显微镜观察，结果见图1。

图1　菌株的菌落形态Fig.1 Colony morphology of the strain

由图1可知，此株菌生长旺盛，菌落为圆形，乳白色，不透明，边缘整齐，表面光滑有光泽，细胞均为丝状，无运动性。孢子形态和菌落形态均符合杜慧竟等［13］对类诺卡氏菌属特点的描述。

2.2菌株生理生化测试

白色类诺卡氏菌株的生理生化特征实验结果见表1。由表1可知，白色类诺卡氏菌可使石蕊牛奶不凝固但会发生胨化、明胶发生液化、淀粉发生水解；能够利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、果糖、甘露醇以及利用蔗糖；不能利用肌醇，纤维素不水解，不还原硝酸盐。根据参考文献［3］和［13］，初步判断该菌株为白色类诺卡氏菌（Nocardioides albus）。

表1　白色类诺卡氏菌株的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of Nocardioides albus

2.3菌株抑菌性

2.3.1紫外线对白色类诺卡氏菌抑菌性的影响

图2　紫外处理对抑菌圈直径的影响Fig.2 Effect of ultraviolet treatment on antimicrobial diameter

由图2可知，白色类诺卡氏菌株经紫外处理以后对菌Pa、Pp、Bs、Sa的抑制性有减小的趋势，其中对于枯草芽孢杆菌Bs菌的抑制性减小趋势最大，对暗黑微绿链霉菌Sa菌的抑制性减小趋势最小，说明Bs菌对白色类诺卡氏菌菌株的变化最敏感。紫外作用30 min对白色类诺卡氏菌产生的抑菌物质影响甚小，此研究结果与肖怀东等［14］报道的在紫外下作用30min，抑菌活性基本没有改变的结果一致。

2.3.2温度对白色类诺卡氏菌抑菌性的影响

图3　不同温度处理对抑菌圈直径的影响Fig.3 Effect of different temperature treatment on antimicrobial diameter

由图3可知，每株指示菌在28℃低温和55℃高温处理下抑菌圈直径有减小的变化，但是枯草芽孢杆菌Bs菌的抑菌圈直径变化趋势最小，说明白色类诺卡氏菌对Bs菌的抑制性较其他几株指示菌更加稳定。结果表明，白色类诺卡氏菌株对实验所选用的这几株指示菌在高温下抑制性比低温下的抑制性更小，可能是由于白色类诺卡氏菌在相对低温下抑菌性更加稳定［15］。

2.3.3pH值对白色类诺卡氏菌抑菌性的影响

由图4可知，酸碱处理白色类诺卡氏菌菌后，抑菌圈直径呈现大幅度的减小趋势，其中酸处理组菌Pa、Pp抑菌圈直径相对碱处理组抑菌圈直径偏小，而菌Bs、Sa出现抑菌圈直径基本一样。说明在强酸、强碱环境中白色类诺卡氏菌基本没有抑菌活性；在碱性的环境下较酸性的环境下相对稳定一些，在酸性条件下，H+可以与营养物质结合，并能从可交换的结合物或细胞表面置换出阳离子，从而影响细胞结构的稳定性［15］。此实验结果与肖远东等的研究结果一致［14］。

2.4白色类诺卡氏菌的抗菌素敏感性

图5　不同抗生素处理条件对抑菌圈直径的影响Fig.5 Effect of different antibiotic treatments on antimicrobial diameter

白色类诺卡氏菌的药敏试验结果见图5。由图5可知，白色类诺卡氏菌株对强力霉素和四环素最敏感，抑菌圈直径≥25 mm，对头孢曲松、丁胺卡那霉素、先锋霉素Ⅵ、卡那霉素、麦迪霉素、氯霉素、先锋霉素Ⅳ、新霉素、万古霉素的敏感程度则相差不大，抑菌圈直径15～25 mm，而只有对先锋霉素Ⅴ表现出耐药性。结果表明，白色类诺卡氏菌对抗生素比较敏感，药敏性较高。

3　结论

通过实验从石油污染的土壤中分离出的白色类诺卡氏菌菌株进行形态观察和生理生化特征检测，将该菌株归属于白色类诺卡氏菌（Nocardioides albus）。通过对白色类诺卡氏菌进行紫外照射、温度处理、酸碱处理的结果显示，紫外作用30 min对白色类诺卡氏菌菌产生的抑菌物质影响甚小；此外，温度对白色类诺卡氏菌产生抑菌物质有微弱的影响，且在相对低温下抑菌性更加稳定；经过强酸、强碱处理后，白色类诺卡氏菌所产生的抑菌物质基本没有活性，且在碱性的环境下较酸性的环境下相对稳定一些。选用12种抗生素对白色类诺卡氏菌菌株进行药敏试验，说明白色类诺卡氏菌对抗生素比较敏感，药敏性较高。

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Separation and identification ofNocardioides albusand preliminary research on its antibacterial activity

LUO Xiaofang1，CHEN Junnan2，TIAN Danni2，WANG Ruting2，MA Linlong2，MO Fangfang2
（1.Center of Experiment，Northwest University for Nationality，Lanzhou 730030，China；2.College of Life Science and Engineering，Northwest University for Nationality，Lanzhou 730030，China）

Nocardioides albuswas isolated and identified.The separated strains were treated with ultraviolet light，temperature and pH.Pseudomonas aeruginosa，Pseudomonas putida，Bacillus subtilisandStreptomyces atrovirenswere used as indicating bacteria，and the antibacterial experiment was conducted with agar diffusion method.Then drug sensitivity test was completed by drug sensitivity test，in order to exploring drug sensitivity and bacteriostatic activity of separated bacteria preliminarily.The results showed that UV treatment for 30 min and temperature treatment had little effect on antibacterial properties.TheN.albusstrain almost had no antibacterial activity under acid and alkali environments.The results showed thatN.albus was sensitive to antibiotics，and its drug sensitivity was high.

Nocardioides albus；separation and identification；antibacterial activity；drug sensitivity

Q93

A

0254-5071（2015）10-0058-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.013

2015-06-16

2013年甘肃省自然科学基金项目（1308RJZA187）；2014年甘肃省教育厅项目（2014B-010）；2015年西北民族大学开放项目；西北民族大学2015年大学生创新创业训练计划项目（201510742079）

雒晓芳（1980-），女，副教授，硕士，主要从事环境微生物方面的研究工作。