L—半胱氨酸对酪氨酸酶的抑制酪氨酸酶催化动力学

2015-10-09方庆秋

科技资讯 2015年18期

方庆秋

摘要：L-半胱氨酸对酪氨酸酶活性有抑制作用，随着L-半胱氨酸浓度的增加而酶活不断受到抑制，并且延滞时间也相应延长。相对稳态酶活力则随着L-半胱氨酸浓度的增大而下降。同时，对酪氨酸酶催化反应的影响及作用动力学机理进行了研究，分析延滞时间产生的根本原因，提出了酪氨酸酶的单酚酶将醌转化为多巴黑色素的非酶反应偶联的反应机理，研究其对酪氨酸酶催化反应的影响及作用动力学机理，为酪氨酸酶抑制剂的设计提供分子模板。

关键词：酪氨酸酶 L-半胱氨酸单酚酶二酚酶抑制动力学

中图分类号：Q356.1 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2015）06（c）-0116-02

酪氨酸酶是合成黑色素的关键酶，是白癜风免疫的重要抗原。最近发现的白癜风患者血清中的酪氨酸酶抗体和白癜风密切相关。可以使皮肤颜色通过抑制酪氨酸酶的活性，以防止皮肤黑色素的形成，即皮肤脱色剂。将某些酪氨酸酶抑制剂应用于美白化妆品。因此，寻找有效的和人体有无不良反应的酪氨酸酶抑制剂已成为医药和化妆品行业的研究和发展趋势。该文以L-半胱氨酸作为效应物，研究其对酪氨酸酶催化反应的影响及作用动力学机理，为酪氨酸酶抑制剂的分子设计的实际应用提供依据。

1 实验方法

1.1 酪氨酸酶活力测定

酪氨酸酶单酚酶活力测定：1.5mmol/LL-酪氨酸为底物，在pH 6.8的磷酸盐缓冲液中，30℃恒温10分钟，加入不同浓度的L-半胱氨酸溶液和酶溶液，在475nm波长下测定吸光度OD值。

酪氨酸酶二酚酶活力测定：1.0 mmol/LL-DOPA为底物，在pH 6.8的磷酸盐缓冲液中，30℃恒温10分钟，加入不同浓度的L-半胱氨酸溶液和酪氨酸酶溶液，在475nm波长下测定吸光度OD值。

2 结果与讨论

2.1 L-半胱氨酸对酪氨酸酶单酚酶的影响

图1可知，随着体系中L-半胱氨酸浓度的增加，抑制单酚酶酶活的能力不断增加。同时，增加L-半胱氨酸浓度能延长单酚酶反应的迟滞时间。当测活体系中不含L-半胱氨酸时，酶反应的延滞时间仅为121秒，但当L-半胱氨酸浓度为30μmol/L时，延滞时间540秒。使酶活力下降50%的L-半胱氨酸浓度（IC50）约为20.3μmol/L。

2.2 L-半胱氨酸对酪氨酸酶二酚酶的影响

图2可知，随着体系中L-半胱氨酸浓度的增加，抑制二酚酶酶活的能力不断增加，导致酶活力下降一半所需的L-半胱氨酸浓度（IC50）为52.0μmol/L。加入L-半胱氨酸后也出现了延滞效应，而当体系中不含L-半胱氨酸时，不存在延滞现象，但当体系中加入L-半胱氨酸后，延滞现象开始出现，并且延滞时间随着L-半胱氨酸浓度的增加而延长，当L-半胱氨酸浓度为100μmol/L时，延滞时间达到了284秒。

2.2 催化动力学模型

由图1和图2可知，从协同效应出发，提出了酪氨酸酶的单酚酶将醌转化为多巴黑色素的非酶反应偶联的反应机理（如图3）。

图3中，T为单酚；D为二酚；QH和Q分别是邻半醌和邻醌；L和DC分别是无色和黑色多巴色素；Emet和Edeoxy分别是活性位点带Cu22+的氧化型酪氨酸酶和带Cu2+的还原型酪氨酸酶；Eoxy是氧化酪氨酸酶；kapp为表观速率常数。

对单酚作用的酪氨酸酶反应体系通过：1、酪氨酸酶的Emet转变为Eoxy态；2、由QH生产二酚和多巴黑色素；3、由Eoxy态返回Emet态等过程而达到稳态。这一过程中，消耗单酚，生成二酚和多巴黑色素，根据由酪氨酸生物合成黑色素的实验测定和计算机模拟得到：

（式1）

式中，和分别为单酚和二酚的最大稳态催化速率，即

，分别为单酚和二酚的Michaelis常数，即

（式2）

（式3）

式中，，

，，为稳态时二酚的浓度，为t=0时的单酚浓度。

根据实验测定F，和上述实验结果，可以求出从单酚或二酚生成的DC的稳态速率，，和。单酚生成DC的速率的方程是