高耐镉硫酸盐还原菌的筛选及鉴定

周冰玉，吴迎奔，陈 薇，刘 标，许 隽，尹红梅，贺月林

（湖南省微生物研究院， 湖南 长沙410009）

随着工业的快速发展，大量含重金属离子的废水排放到环境中，引起了严重的重金属污染。一直以来，由于未得到有效治理，重金属逐渐向江河湖海、地下水以及废水流经区域的土壤中积累，给农业生产和人类健康带来严重威胁，尤其是重金属镉污染已成为一个全球性问题[1-2]。因此，废水中重金属污染治理是当前急需解决的重大问题，也是目前许多科研工作者的研究热点。

目前，废水中镉污染的治理方法主要有物理法、化学法和微生物修复法。但物理和化学方法所使用的材料较昂贵且使用寿命短，处理废水的成本较高，易引起二次污染。而微生物修复法因其具有来源丰富、处理成本相对较低、对环境影响小等优点，引起了科研工作者的广泛关注[3-4]。

硫酸盐还原菌是指一类能把硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等硫氧化物及元素硫还原形成硫化氢的细菌的统称[5]。与其他类型的重金属微生物修复菌剂相比，用硫酸盐还原菌修复废水镉污染最大的优势在于其去除水体中镉离子的效率更高，而且对多种重金属离子都有去除效果[6]。作为一种可高效去除废水中重金属离子的微生物，硫酸盐还原菌越来越被研究者们重视，从而广泛应用到工业废水、灌溉用水、养殖废水等的修复领域[7]。实验室从重金属污染废水中分离了12 株硫酸盐还原菌，并对其镉耐受能力和吸附能力进行了测试，以期为硫酸盐还原菌处理含镉废水提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

废水样品采自湖南某地工业区。试验所用的富集和固体培养基参照国家农业部成都沼气所的配方。富集培养基成分为：NaCl 2.0 g/L、Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.5 g/L、NH4Cl 1.0 g/L、MgSO4·7H2O 2.0 g/L、Na2SO40.5 g/L、K2HPO40.5 g/L、70%乳酸钠5 m l/L、酵母膏1.0 g/L，pH 值7.5。固体培养基即在上述培养基中按照20%的比例加入琼脂粉。

1.2 试验方法

1.2.1 硫酸盐还原菌的富集培养 取1 m L 废水样品加入装有100 m L 液体培养基的盐水瓶中，盖好瓶盖后放入厌氧培养箱中35℃静置培养，待培养液变成墨黑色，用醋酸铅试纸检测有大量H2S 生成后转接，如此重复5 次，每次接种量1%。

1.2.2 硫酸盐还原菌的分离纯化 将富集培养后的菌液稀释到10-6，平板划线，用封口膜密封后置厌氧培养箱中35℃培养7 d 后，从中挑取长势良好、浓黑色的单菌落于斜面中保存。

1.2.3 硫酸盐还原菌的初步鉴定 在光学显微镜下观察活体细菌的运动特征、细胞形态；硫酸盐还原菌的革兰氏染色、芽孢染色和鞭毛染色方法见《微生物学实验》[8]。

1.2.4 菌株对镉的耐受能力 将获得的12 株硫酸盐还原菌，按2%的接种量接种于含5、10、20、40、80 mg/L 镉离子的富集培养基中，于35℃、150 r/m in 厌氧培养7 d，然后将富集培养后的菌液涂布于固体培养基上，用封口膜密封后置厌氧培养箱中35℃培养，挑取各平板上的单菌落进行斜面保藏。

1.2.5 菌株对镉的吸附能力 将获得的4 株耐镉硫酸盐还原菌，按2%的接种量接种于含20、40、80 mg/L镉的富集培养基中，于35℃、150 r/m in厌氧培养7 d，设3个重复，以接等量无菌水和死菌体为对照。针筒取样，10 000 r/m in离心10 m in，取上清液备用，对照采用同样方法进行处理。利用电感耦合等离子体发射光谱法测定各处理上清液中镉的浓度。各菌株对培养液中镉的吸附率（%）=（C0-Ct）/C0×100。其中，C0为蒸馏水对照上清液中镉的浓度；Ct为吸附后上清液中镉的浓度。

2 结果与分析

2.1 硫酸盐还原菌的分离及初步鉴定

经多次富集培养和分离，获得12 株硫酸盐还原菌，分别编号为S-1～S-12。12 株菌株的菌落特征和细胞形态特征见表1。其共同特征为菌落黑色，同为革兰氏阴性菌，细胞形状主要为杆状或弧状，不产芽孢，单极生鞭毛，运动特征以翻滚式运动和旋转式运动为主；各菌株的区别仅在于菌体大小不同。对照《伯杰氏系统细菌分类学手册》中对脱硫弧菌属硫酸盐还原菌的描述：多弧状，偶有杆状，无芽孢，革兰氏阴性，初步判定分离得到的菌株属脱硫弧菌属。

2.2 耐镉硫酸盐还原菌的分离纯化

表1 各硫酸盐还原菌的菌落形态和细胞形态特征的比较

对12 株硫酸盐还原菌进行分离纯化，结果如表2所示，当培养基中镉离子浓度提高到80 mg/L，仍有4株菌株可以生长，分别为S-3、S-11、S-5 和S-10。

2.3 高耐镉硫酸盐还原菌对镉的吸附能力

4 株耐镉硫酸盐还原菌经过7 d 培养后，各菌株对不同浓度含镉培养液（分别含镉20、40、80 mg/L）中Cd+的吸附能力见图1～图3。当培养液含镉20 mg/L时，各菌株对镉的吸附能力较强，吸附率在87.27%±1.097%～84.37%±3.758%之间；随着镉浓度的增加，各菌株对镉的吸附能力随之降低；在镉离子浓度为80 mg/L 的培养液中，菌株S-10 和S-11 的吸附能力较强，分别为70.63%±1.856%和72.27%±3.163%。耐镉能力相对较弱的菌株却表现出较强的镉吸附能力。

当培养基中镉离子初始浓度为20 mg/L 时，死菌体细胞对溶液中镉的吸附率为30.00%±3.835%～39.43%±2.639%；随着镉浓度的增加，死菌体对镉的吸附能力亦随之降低；在镉离子浓度为80 mg/L 的培养液中，死菌体对镉离子的吸附能力仅8.033%±0.404 1%～8.90 0%±0.435 9%。

表2 硫酸盐还原菌在不同浓度含镉培养基中生长情况

图1 4 株耐镉菌株对含镉20 mg/L 的培养液中Cd2+的吸附

图2 4 株耐镉菌株对含镉40 mg/L 的培养液中Cd2+ 的吸附

图3 4 株耐镉菌株对含镉80 mg/L 的培养液中Cd2+ 的吸附

3 结论与讨论

经过多次的富集分离，得到4 株高耐镉硫酸盐还原菌，其细胞呈弧形，无芽孢，为革兰氏阴性，初步判定4 株高耐镉硫酸盐还原菌属脱硫弧菌属。下一步拟通过生理生化、16S rDNA 基因序列、G+C 含量的测定以及DNA-DNA 杂交分析进一步判断4 株高耐镉硫酸盐还原菌在分类学上的地位。

镉耐受试验结果表明，S-3、S-5、S-10、S-11 菌株具有较强的镉耐受能力，在镉浓度高达80 mg/L 时，仍能正常生长。4 株菌的镉吸附试验结果显示，各菌株活菌体对溶液中的镉均有较强的吸附能力。在含镉80 mg/L 的培养液中，菌株S-10 和S-11 的吸附能力较强，分别达70.63%±1.856%和72.27%±3.163%。

利用吸附能力强的微生物修复重金属污染水体，可以克服物理和化学方法易造成二次污染的缺点，具有良好的应用前景。试验获得的4个菌株对镉吸附能力强，效率高，有望成为处理含镉废水的理想菌种。但是，菌株S-3、S-5、S-10、S-11 的吸附机理及其对实际重金属矿山污染废水的处理效果仍需进一步研究。

[1]刘丽君.水环境中镉污染处理的研究进展[J].环境科学与管理，2012，37（6）：124-127.

[2]黄宝圣.镉的生物毒性及其防治策略[J].生物学通报，2012，40（11）：26-28.

[3]沈 萍，朱国伟.含镉废水处理方法的比较[J].污染防治技术，2010，23（6）：56-59.

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[5]马保国，胡振琪，张明亮，等.高效硫酸盐还原菌的分离鉴定及其特性研究[J].农业环境科学学报，2008，27（2）：608-611.

[6]Sponza D T.Investigation ofextracellular polymer substances（EPS）and physicochemical properties of different activated sludge flocs under steady-state conditions[J].Enzyme and Microbial Technology，2003，32（3-4）：375-385.

[7]潘响亮，王建龙，张道勇，等.硫酸盐还原菌混合菌群胞外聚合物对Cu2+的吸附和机理[J].水处理技术，2005，31（9）：25-28.

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