星点设计-效应面法优化四物汤中挥发油包合工艺

杨欢，何瑶，刘婷婷，傅超美，周莉江

实验室 四川省中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

《四物汤》出自于唐朝蔺道人所著《仙授理伤续断秘方》。全方由熟地黄、当归、白芍、川芎组成，具有补血和血的功效，主治营血虚滞症[1]。本方是补血常用方，也是调经的基本方。因其常用于妇科疾病，故称誉为“妇科圣方”。目前国内已有四物合剂、四物片、四物胶囊、四物颗粒作为中成药品种上市销售。在四物汤系列制剂中：四物合剂、四物片、四物胶囊、四物颗粒制法项下均规定，当归、川芎须先经水蒸气蒸馏以充分获取所含有的挥发性成分。同时，药理研究表明，四物汤中挥发油具有抗炎、镇痛、双向调节子宫平滑肌等作用[2~3]，为四物汤中的重要活性成分[4]。四物汤中挥发油主要成分为藁本内酯，但藁本内酯性质极不稳定[5~6]。近年来，β-环糊精包合技术广泛用于固体制剂中挥发油的包合，可增强挥发油对光热的稳定性，具有矫臭矫味，提高生物利用度，使液体药物固体化[7]等优点。本文先采用正交设计法对挥发油提取工艺进行筛选，再利用星点设计优化挥发油包合工艺，从而较好提取四物汤中的挥发油，并有效提高挥发油的稳定性。

1 材料与仪器

1.1 药材与试剂

熟地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.干燥块根的炮制加工品（太极集团四川绵阳制药有限公司，批号：1311007）。当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels.的干燥根（太极集团四川绵阳制药有限公司，批号：1311008）。川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根茎的炮制加工品（四川浩博药业有限公司，批号：131201）。白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根（太极集团四川绵阳制药有限公司，批号：1312006）。以上中药饮片，经检验符合《中国药典》(2010年版)标准。β-环糊精（成都市科龙化工试剂厂，批号：20120813）。

1.2 实验仪器

挥发油提取器（北京西苑玻璃仪器公司），DZG- 6020 型真空干燥箱( 上海森信实验仪器有限公司)，HH-SJ集热式恒温磁力搅拌器（金坛市城东新瑞仪器厂）。

2 方法与结果

2.1 挥发油提取工艺研究

根据预试验结果，取四物汤中当归、川芎饮片（或粉末）各50 g，浸泡30 min，采用水蒸气蒸馏法提取四物汤中的挥发油。按照L9(34) 正交设计法，以当归、川芎粉末粒度（A）、加水量(B)、提取时间(C)为主要影响因素，以挥发油得率为评价指标，对挥发油的提取工艺进行筛选，因素水平见表1，正交试验结果见表2，方差分析见表3。实验结果表明：对四物汤挥发油提取的影响由大到小为：粉末粒度>提取时间>加水量。由方差分析可知：四物汤挥发油的提取过程中，粉末粒度对提取率具有极显著影响（p<0. 01），提取时间具有显著影响（p<0. 05），正交试验筛选的挥发油提取工艺为：A3B3C2，即取当归、川芎饮片粉碎成中粉，加入8倍量的水，水蒸气蒸馏提取5 h。按照以上工艺进行三批次验证实验，实验结果（见表4）表明该工艺挥发油得率稳定，其收率为0.89%。

表1 挥发油提取因素水平表

表2 挥发油提取L9(34)正交试验结果表

表3 方差分析表

表4 正交实验工艺验证结果

2.2 星点试验设计优化四物汤挥发油包合工艺

2.2.1 星点试验设计 采用β-环糊精包合方法中的饱和水溶液法，以β-环糊精(g) :挥发油(mL)比例、包合温度（℃）及包合时间(min)为自变量，以挥发油利用率（%）、包合物收得率（%）总评归一值OD为因变量，每个因素设 5 水平，用代码－α、－1、0、+1、+α来表示，因素水平见表5，星点设计及结果见表6。

挥发油的利用率和收得率是衡量包合效果的重要指标，利用率(反映质量)越高，收得率(反映产量)越高，包合效果越好。

挥发油利用率Y1%=包合物挥发油量 /（挥发油加入量×空白回收率）×100%

包合物收得率Y2%=包合物重量/（β-环糊精重量+挥发油重量）×100%

表5 星点设计因素水平表

2.2.2 空白回收试验 精密量取当归-川芎挥发油l mL，加无水乙醇1.5 mL使溶解，置500 mL烧瓶中，加蒸馏水100 mL和沸石数粒，连接挥发油提取器，按照《中国药典》2010版附录XD项下，挥发油测定法提取挥发油，至油量不再增加时停止加热(约5小时)，放置1 h，读取挥发油量。计算空白回收率，测得回收率为91%。

2.2.3 试验设计及结果 β-环糊精包合物的制备方法：本文选用饱和水溶液法进行包合。各试验号按星点设计因素水平表要求在设计温度下配制β-环糊精饱和水溶液，加入挥发油l mL进行包合实验。包合完毕后，置冰箱冷藏，抽滤，减压干燥，即得白色粉末状包合物。四物汤挥发油包合工艺试验设计及结果见表6

表6 四物汤挥发油包合工艺试验设计及结果

17 0 0 0 70.4 79.86 0.784664 18 0 0 0 71.38 81.4 0.811439 19 0 0 0 71.87 80.62 0.808042 20 0 0 0 71.49 80.48 0.80262

2.2.4 总评归一值（OD）的计算 将表6中挥发油利用率（Y1）、包合物收得率（Y2）数值标准化为0-1间的归一值,并将归一值求算几何平均数，得总评归一值（Overall Desirability，OD）。OD=(d1×d2×.….×dn)1/n，n为指标数，本实验的指标数为2。挥发油利用率（Y1）、包合物收得率（Y2）取值均为越大越好。对取值越大越好的效应采用Hassan方法分别进行数学转换求“归一值”dmax。

2.2.5 模型拟合 以OD值为因变量对各因素进行多元线性回归和二项式拟合，使用Design-Expert8.0软件拟合模型。

多元线性回归方程为：

二项式拟合方程为：

方差分析见表7，结果显示该模型具有高度的显著性，方差的可信度及拟合度均较好，故可用此模型对挥发油包合工艺进行预测和分析。

表7 四物汤挥发油包合工艺方差分析

2.2.6 工艺优化与预测 采用Design-Expert8.0软件对包合工艺进行优化和预测。结果表明最优工艺为：β-环糊精(g) :挥发油(ml) = 9.80:1，包合温度为40℃，包合时间110 min，预测OD值为0.9882。效应面图及等高线图见图1到图6。

图1 环糊精比例和包合温度对OD值的效应面图

图2 环糊精比例和包合温度OD值的等高线图

图3 环糊精比例和包合时间对OD值的效应面图

图4 环糊精比例和包合时间对OD值的等高线图

图5 包合温度和包合时间对OD值的效应面图

图6 包合温度和包合时间对OD值的等高线图

2.2.7 验证试验 根据效应面优化的最佳工艺进行三批工艺验证实验，制备四物汤挥发油β-环糊精包合物，其利用率为81.17%，收得率为87.4%（见表8）。结果表明，二项式拟合方程预测值与实测值的偏差为1.13 %，[偏差= (预测值-实测值) /预测值×100% ] ，说明二项式拟合效果良好，可信度高。

表8 最佳工艺验证结果

3 讨论

四物汤中的挥发油是四物汤的一个重要活性部位，特别是其主要成分藁本内酯具有调经、镇痛、抗炎、解热等药理作用，但藁本内酯化学性质不稳定[8~9]。为了充分发挥四物汤制剂中挥发油的疗效，本研究将其用β-环糊精包合，不仅可以保留挥发油的生理活性，而且能掩盖挥发油的气味，提高制剂的生物利用度，便于制剂成型，更重要的是可以提高挥发油的稳定性。星点设计-效应面优化法具有精密度高、预测值接近真实值等优点[10]。本研究通过正交试验优选出四物汤挥发油提取工艺，再利用星点试验设计优化得到四物汤挥发油最佳包合工艺。经验证，优化后的工艺参数能较好提取四物汤中的挥发油，并使β-环糊精包合挥发油后的挥发油利用率、包合物收得率较高。该工艺稳定可行，能有效提高四物汤制剂中挥发油稳定性，为后期四物汤系列制剂制备工艺优化及新制剂研发提供参考和依据。

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