两种卵黄抗体不同提取方法的比较试验

林婷婷王全溪

（1.龙岩市农业学校　福建龙岩　364000；2.福建农林大学动物科学学院　福州　350002）

两种卵黄抗体不同提取方法的比较试验

林婷婷1王全溪2

（1.龙岩市农业学校福建龙岩364000；2.福建农林大学动物科学学院福州350002）

卵黄抗体（IgY）具有许多其他类型抗体所没有的优点，其分离纯化的方法有有机物抽提法、盐析法、水稀释法等。试验分别用聚乙二醇（PEG）6000和氯仿来提取卵黄抗体，对其收集的抗体量和抗体效价进行比较分析。结果表明：100 g的卵黄用PEG6000法比氯仿法多收集71m L卵黄抗体溶液，且PEG6000法的成本远远低于氯仿法，有很好的经济效益，而PEG6000法提取的卵黄抗体效价比氯仿法略低一个滴度。

卵黄抗体提取 氯仿聚乙二醇6000

卵黄抗体（yolk antibody）是禽类B淋巴细胞在抗原物质刺激下所产生并沉积在卵黄中能与特异抗原结合的一种免疫球蛋白，称为IgY［1-2］。现已证明特异性IgY对人及动物的许多疾病具有一定的预防和治疗作用，可用来预防和治疗多种没有特效药物的禽类传染病 （如新城疫、禽流感、禽传染性法氏囊炎［3］）、初生仔猪和犊牛腹泻及其他许多疾病，在疾病的免疫检测和防治方面有突出的应用，还可以作为饲料添加剂与蛋白质研究素材。

IgY抗体存在于丰富的卵黄脂质中，不容易被分离，使得鸡蛋作为抗体来源的研究受到限制。近年来，出现了许多提取卵黄蛋白的方法，如有机物沉淀法使用聚乙二醇与硫酸葡聚糖，有机溶剂抽提法应用氯仿分离IgY，天然胶法，还有中链脂肪酸法，用辛酸静置分层卵黄抗体，还有去污剂分离法，水稀释法及超临界气体提取法等［4］。为了更好地提取卵黄抗体，以发挥其优势，选用操作比较简单，材料取得也较容易的氯仿和聚乙二醇6000来提取卵黄抗体，前人的研究也表明，这两种方法分离卵黄抗体的提取率和纯度相对比较大。用氯仿和25%聚乙二醇6000［5］提取卵黄抗体，分别从收集量、抗体效价、消耗与成本等问题作比较研究，以确定一个比较好的提取方法。

1　材料与方法

1.1试验仪器组织捣碎机；离心机；V形微量反应板；50μL移液管；滴头。

1.2试验材料免疫鸡蛋：由龙岩某鸡场提供，经常规新城疫免疫程序免疫母鸡所产的蛋；生理盐水500 mL/瓶；氯仿：分析纯500 mL/瓶；聚乙二醇（PEG）6000：分析纯500 g/瓶；新城疫抗原：Ⅳ系（Lasota株）疫苗；25%聚乙二醇6000溶液：称取5 g聚二乙醇6000完全溶于20mL蒸馏水中，备用；1%鸡红细胞液。

1.3试验方法分别用氯仿和聚乙二醇6000做3次重复试验。每次试验，取4枚新鲜高免鸡蛋用自来水洗去蛋壳表面的污物，再用蒸馏水冲洗两遍，经1%新洁尔灭浸泡消毒后无菌分离卵黄，均匀搅拌分成等量的两份，以保证同次试验中两种不同方法提取的卵黄抗体相同。称重后，两份卵黄用氯仿法和聚乙二醇法分别提取。

1.3.1氯仿提取法在无菌分离的卵黄中加入2倍量灭菌生理盐水，用组织捣碎机搅拌成蛋黄液，测量蛋黄液的量。然后按蛋黄液量的两倍加入氯仿，充分摇匀，置室温 1～2 h，3 000 r/min离心抽提 15～20min。无菌收集上清液，得卵黄抗体溶液，测量收集液的量。

1.3.2聚乙二醇6000（PEG6000）沉淀法［6］在无菌分离的卵黄中加入2.5倍量灭菌生理盐水，搅拌成蛋黄液，测量蛋黄液的量。按蛋黄液量的1/10加入25%PEG6000溶液，8 000 r/min匀浆3min，置4℃冰箱内8～12 h。无菌收集下层清液，得卵黄抗体溶液，测量收集液的量。

1.3.3新城疫抗体效价的测定为比较两种提取方法的效果，通过血凝（HA）和血凝抑制试验（HI）检测提取后卵黄抗体中新城疫抗体效价［7］。

2　结　果

2.1试验结果观察氯仿法为有机溶剂抽提法［4］，通过氯仿进行分离，离心后可得三相，上层水层，为卵黄抗体的水溶性组分，中层半固体相为分离出的脂类及脂蛋白，下层为氯仿层。抽取上层清液，即得初步提取的卵黄抗体溶液。聚乙二醇6000法为有机物沉淀法［4］，上层为黄色蓬松样固体，蛋白质于下层清液，收集得卵黄抗体溶液。氯仿法收集液较为澄清，呈无色，PEG6000法收集液较为浑浊，呈淡黄色。

2.2两种方法收集量的结果比较三次重复试验，测量两种收集液的量，结果如下：第一次试验用23 g卵黄，氯仿法得到收集液43mL，25%PEG法得到收集液57mL；第二次试验用23.5 g卵黄，氯仿法得到收集液41 mL，25%PEG法得到收集液60 mL；第三次试验用24 g卵黄，氯仿法得到收集液46 mL，25%PEG法得到收集液63 mL。通过计算，1 g卵黄用氯仿法平均可提取1.84 mL卵黄抗体液，用25%PEG法平均可提取2.55 mL卵黄抗体液，100 g卵黄用PEG6000法比氯仿法可多收集71 mL卵黄抗体溶液，则氯仿法提取100 mL卵黄抗体液要54 g卵黄，25%PEG提取100 mL卵黄抗体液要39 g卵黄。由结果所得，PEG法的收集量大于氯仿法（见表1）。

表1　卵黄抗体液收集量的分析

2.3收集液新城疫抗体效价检测结果

2.3.1新城疫病毒的血凝价三次试验中，血凝试验使用的是同一抗原，其血凝价为1：256，则1：64为其四个凝集单位。

2.3.2收集液新城疫抗体效价根据HA试验结果，1：64为四个凝集单位作固定病毒稀释卵黄抗体液，每次检测都做三次重复，以100%抑制凝集的抗体最大稀释度为该抗体的滴度，即抗体效价。结果如下：第一次试验，氯仿法的平均新城疫抗体效价为1：256，25%PEG法的平均新城疫抗体效价为1：128；第二次试验，氯仿法的平均新城疫抗体效价为1：512，25%PEG法的平均新城疫抗体效价为1：256；第三次试验，氯仿法的平均新城疫抗体效价1：256，25%PEG法的平均新城疫抗体效价1：256。氯仿法提取的卵黄抗体中新城疫抗体效价约比25%PEG法高一个滴度。

2.4经济效益分析氯仿法中，直接加入卵黄液量两倍的氯仿，消耗大，1份卵黄需要6倍量氯仿。即（1份卵黄+2份生理盐水）=卵黄液+两倍卵黄液的氯仿。而PEG法，若换算成卵黄量和PEG固体的比例，则为 （1份卵黄+2.5份生理盐水）=卵黄液+含10%卵黄液的25%PEG溶液，一份卵黄量只需要7/80份PEG6000固体。

氯仿分析纯 （500mL/瓶）的价格为25元/瓶，PEG6000分析纯（500 g/瓶）的价格为30元/瓶。生理盐水 （500mL/瓶）的价格为5元/瓶。以下以提取100mL卵黄抗体液的成本进行比较分析。氯仿法提取100 mL卵黄抗体液需54 g卵黄，25%PEG法提取100mL卵黄抗体液需39 g卵黄。则提取100mL卵黄抗体液用氯仿法需要氯仿54×6=324 mL，用25%PEG法需要PEG6000为39×（7/80）=3.4 g。氯仿法药品的成本为 （324/500）×25=16.2元，25%PEG法药品的成本为（3.4/500）×30=0.20元。提取100mL卵黄抗体液，用氯仿法所需的生理盐水量为54×2= 108 mL，用25%PEG法所需的生理盐水量为39× 2.5=97.5mL。氯仿法生理盐水的成本为（108/500）× 5=1.08元，25%PEG法生理盐水的成本为（97.5/500）×5=0.98元。氯仿法的总成本约为17.28元，25%PEG法的总成本约为1.18元（见表2）。

在生产中提取100 L卵黄抗体液，氯仿法的成本约为17 280元，25%PEG法的成本约为1 180元，相差近十五倍，25%PEG法的成本远低于氯仿法，有很好的经济效益。

3　小结与讨论

表2　成本分析表

1）从试验情况来看，氯仿法和聚乙二醇法提取卵黄抗体的操作都相对简单。1 g卵黄用氯仿法平均可提取约1.84mL卵黄抗体液，用25%PEG法平均可提取约2.55mL卵黄抗体液，则100 g卵黄用PEG6000法比氯仿法多收集71 mL卵黄抗体溶液。100 mL卵黄抗体液用氯仿提取总成本约为17.28元，用25%PEG总成本约为1.18元，25%PEG法的经济效益远大于氯仿法。而25%PEG提取的卵黄抗体液新城疫效价比氯仿提取的低一个滴度。25%PEG法提取的清液较氯仿法浑浊，有较多的杂蛋白，但是初步提取的卵黄抗体都还必须用其他方法进一步提纯，而PEG法的成本低、收集量大，在工业生产中还是有很大的优点，因此，适合于大规模生产和使用。

2）两种提取方法的原理。（1）氯仿法：氯仿是优良的有机氯溶剂，亦称为三氯甲烷，能迅速溶解脂肪、油脂、树脂和蜡，为有机物抽提法。由于卵黄里的脂肪、脂蛋白易溶于有机溶剂，以生理盐水稀释蛋黄，让其中的IgY能够溶于水中，通过离心抽提得到IgY水溶性成分于上层清液，中层为密度较轻的脂类脂蛋白及其他蛋白，下层为密度最大的氯仿层。（2）聚乙二醇（PEG）6000法：聚乙二醇（PEG）是非离子型水溶性聚合物［8］，有很强的亲水性，其强亲水性可以破坏蛋白质的水化层。聚乙二醇（PEG）6000就是通过抗体蛋白的亲水和疏水性，破坏蛋白质的水化层来分离提取卵黄抗体。PEG溶液于水中不发热升温，即使浓度很高也不会引起蛋白质变性［8］。25% PEG6000溶液提取卵黄抗体，静置后可分两层，上层为黄色蓬松样固体，下层为卵黄抗体清液。

3）两种提取方法的比较。（1）工作量与耗时：氯仿法只需搅拌一次蛋黄液，直接加入氯仿后，静置、离心，在实验室里，离心方法简便易操作。PEG法必须配置25%PEG溶液，加入PEG溶液后还需高速匀浆，但不需要离心处理。而其水溶性组分的收集，氯仿法的上层清液收集较PEG法下层液体简易。氯仿法加入氯仿后需静置1～2 h，而PEG法需要在4℃条件下放置8～12 h，耗时较长。（2）残留与毒性：在氯仿法中，三氯甲烷会有一部分残留在卵黄抗体提取物中。三氯甲烷对哺乳动物可引起DNA损伤，可引起淋巴姐妹染色体发生变化。三氯甲烷能引起肌肉、骨骼、肠胃系统及颅面部发育不正常，有高度的胎毒，会引起人的慢性中毒如呕吐、消化不良、食欲减退、神经过敏、失眠抑郁，对人并有致癌作用。有研究表明，氯仿法进行卵黄抗体提取，其残留的氯仿会影响酶标板的吸附力，增加了非特异性吸附［9］，不适用于ELISA检测。PEG作为高亲水性聚合物，在卵黄抗体液中也会有残留。但PEG对于动物是否有毒性，目前尚不详［8］。

4）试验中，氯仿法加入的生理盐水量小于PEG6000，而氯仿法收集液的量也小于聚乙二醇法，因此，收集液的多少可能与生理盐水的加入量有关。氯仿法提取的卵黄抗体效价略高于聚乙二醇6000法一个单位，这也可能是PEG6000法中加入的生理盐水量大于氯仿法，降低了抗体的滴度。因此，在卵黄抗体效价比较中，不仅要考虑不同提取药品对效价的影响，也要考虑其中生理盐水有可能对效价的影响。试验中采用25%PEG提取的清液较氯仿法浑浊，有较多的杂蛋白，但是初步提取的卵黄抗体都还必须用其他的方法进一步提纯。氯仿法在制备过程耗时少，上清液中脂类污染极微，卵黄抗体液较为清亮，纯度相对较大，但由于其有残留和毒性，成本又高，在抽提过程中有大量沉淀，不适合连续离心，因此，适合于实验室少量制备。

5）在卵黄抗体的生产上，目前还没有完善的质量和管理标准，一些生物制品单位生产的卵黄抗体未进一步加以纯化，不符合药品规范，经稀释后直接用于被动免疫保护，由于卵黄液中含有大量不饱和脂肪酸和磷脂，极易腐败变质，对动物产生毒性。在这样的情况下，卵黄抗体的分离、提取、纯化就显得很重要。而我们的目标就是通过对卵黄抗体分离提取方法的研究，建立一套完善的药品规范与质量标准，以更好地发挥卵黄抗体的作用与优势。

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The com parison trial about two kinds ofmethod in w ithdraw ing the yolk antibody

Lin Tingting1Wang Quanxi2
（1.Longyan agricultural school，Fujian 364000；2.College of animal science，Fujian agriculture and forestry university，Fuzhou 350002）

The yolk antibody（IgY）had more advantages thanmany other types of antibody，but itwas difficult to separate and purify. Themethod of separation and purification of IgY were extraction of organic compounds，salt fractionation，water dilution.Chloroform and PEG6000 were used to withdraw yolk antibody respectively in this experiment，then the antibody level of Newcastle Disease was examined.The result showed that themethod of using PEG6000 collected 71mL solution of IgY more than themethod using chloroform from 100 g yolk and the first one which was good and economic benefit cost far less than the other one.The antibody level of IgY by the firstmethod was lower however.

yolk antibody withdrawing chloroform PEG6000

A

1003-4331（2015）03-0003-04