HPLC-UV和HPLC-ELSD法测定蜜炙酸枣仁中酸枣仁皂苷A含量的比较

隋利强，黄礼书，陈喆明

（福建中医药大学，福建 福州　350108）

HPLC-UV和HPLC-ELSD法测定蜜炙酸枣仁中酸枣仁皂苷A含量的比较

隋利强，黄礼书，陈喆明

（福建中医药大学，福建 福州350108）

［目的］建立蜜炙酸枣仁中酸枣仁皂苷A的含量测定方法。［方法］采用反相高效液相色谱法，以WondaCract ODS-2 （250 mm×4.6 mm，5μm）为色谱柱，乙腈-水为流动相，ELSD漂移管温度为80℃，气体流量为1.5 ml/min。紫外检测波长为204 nm；流速为1 ml/min，柱温为30℃。［结果］HPLC-ELSD法测定酸枣仁皂苷A的线性范围为0.05～0.2 mg/ml，r=0.9952，平均回收率为102.97%，RSD=0.79%（n=6）。HPLC-UV法测定酸枣仁皂苷A的线性范围为0.005～0.2 mg/ml，r=0.9990，平均回收率为98.64%，RSD=2.05%（n=6）。［结论］两种检测方法测定酸枣仁皂苷A的含量结果相近，但HPLC-ELSD法的稳定性更好，HPLC-UV法由于吸收度低，峰面积相对较小，存在一定误差。

HPLC-UV；HPLC-ELSD；蜜炙酸枣仁；酸枣仁皂苷A

酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus Jujaba Mill.var.spinosa （Bunge）HU ex H.F.chou的种子，是临床应用较为广泛的中药，具有养肝、宁心安神、生津、敛汗的功效，临床主要用于治疗失眠、心脾气血两虚、脾不统血、阴亏内热、心神不宁等［1］。酸枣仁临床常用生酸枣仁、炒酸枣仁，药典也收载上述两种饮片。除此之外，福州地区习惯用蜜炙酸枣仁，且用药历史悠久，该饮片收载于《福建省中药饮片炮制规范》［2］。

现代研究表明酸枣仁含酸枣仁皂苷、三萜化合物等，具有镇静、催眠、安神的作用。酸枣仁皂苷A是2010年版药典中酸枣仁质量标准的质量控制成分，目前对该成分的检测多采用HPLC-ELSD法，部分文献报道采用HPLC-UV法。本研究参考有关文献［3-5］，分别采用HPLC-UV和HPLC-ELSD法测定了蜜炙酸枣仁中酸枣仁皂苷A的含量，旨为建立蜜炙酸枣仁中酸枣仁皂苷A更好的质量控制方法。

1　仪器与试药

1.1仪器电子天平（梅特勒-托利多称重设备有限公司，XS105型）；电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司，京制00000246）；高效液相色谱仪（Agilent Technologies 1200 series，Alltech 3300 ELSD和二极管阵列检测器）。

1.2试药甲醇（批号为20141218，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（批号为20140321，国药集团化学试剂有限公司）；酸枣仁（批号为20141107，陇西聚堂中药材实业有限公司）；酸枣仁皂苷A（含量为98.60%，MuST-14042311，中国科学院成都生物研究所）。蜜炙酸枣仁由本课题组按《福建省中药饮片炮制规范》蜜枣仁项下方法加工炮制。

2　HPLC-ELSD检测方法

2.1对照品溶液的制备取酸枣仁皂苷A对照品10 mg，精密称定，置于10 ml容量瓶中加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，即得。

2.2供试品溶液的制备参考文献［4-5］，取蜜枣仁样品粉末（过4号筛）约1 g，精密称定，置索式提取器中，加石油醚（60%～90%）适量，加热回流4 h，弃去石油醚液，药渣挥去溶剂，转移至锥形瓶中，加入70%乙醇20 ml，加热回流2 h，滤过，滤渣用70%乙醇5 ml洗涤，合并洗液与滤液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3色谱条件色谱柱:WondaCract ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相:乙腈-水；ELSD漂移管温度:80℃；气体流量: 1.5 ml/min；紫外检测波长:204 nm；柱温:30℃；流速:1 ml/min；进样量:10 μl；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱，洗脱条件见表1；理论板数按酸枣仁皂苷A峰计算应不低于2 000。在此色谱条件下，分别精密吸取对照品、供试品溶液各10 μl进样测定，HPLC图见图1。

2.4线性关系考察精密吸取酸枣仁皂苷A对照品贮备液0.1 ml、0.15 ml、0.2 ml、0.3 ml、0.4 ml，分别置于2 ml容量瓶中，加甲醇定容，配成系列对照品溶液（0.05 mg/ml、0.075 mg/ml、0.1 mg/ml、0.15 mg/ml、0.2 mg/ml）。按上述色谱条件进样测得各浓度峰面积，以峰面积对数LogA为纵坐标，浓度C为横坐标，得回归曲线Y=7.9194X+1.8502，r=0.9952，结果显示酸枣仁皂苷A在浓度0.05～0.2 mg/ml范围内有良好线性关系，结果见图2。

表1　梯度洗脱条件

图1　HPLC色谱图

图2　酸枣仁皂苷A标准曲线

2.5精密度试验精密量取对照品溶液（1 mg/ml）0.2 ml于2 ml容量瓶中，加甲醇定容，进样量为10 μl，分别连续进样5次，结果对照品峰面积的RSD=0.66%（n=6），结果见表2。

2.6稳定性试验精密量取对照品溶液（1 mg/ml）0.2 ml 于2 ml容量瓶中，加甲醇定容，进样量为10 μl，分别于0 h、2 h、4 h、6 h和8 h进行测定，结果对照品峰面积的RSD= 0.61%（n=5），结果见表3。

2.7重复性试验取同一样品5份，每份1 g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备溶液，分别进样，进样量为10 μl，分别测定峰面积，结果RSD为1.75%（n=5），见表4。

表2　精密度试验结果（mAU）

表3　稳定性试验结果（mAU）

表4　重复性试验结果（mAU）

2.8加样回收试验精密量取已知含量（0.124 mg/ml）样品溶液0.35 ml，加入0.3 ml对照品溶液（0.1 mg/ml），摇匀，进样10 μl进行测定，平行测定6份。计算平均回收率，结果平均回收率为102.97%，RSD=0.79%（n=6）。说明该方法测定结果准确。具体结果见表5。

表5　加样回收实验测定结果　（n＝6）

2.9样品含量测定样品按“2.2供试品溶液的制备”方法制备样品溶液，精密吸取样品溶液10 μl，依照“2.3”色谱条件进行测定，每个样品平行测定3次，扣除含水量得结果见表6。

表6　样品含量测定结果　（n＝3）

3　HPLC-UV检测方法

3.1色谱条件及系统适用性试验按“2.1”及“2.2”项方法制备对照品溶液及供试品溶液。检测器为二极管阵列检测器，检测波长为204 nm。酸枣仁皂苷A对照品与供试品HPLC图谱如图2。

3.2线性关系考察实验方法同“2.4”项，结果得回归方程为Y=33.62X-0.765，相关系数r=0.9990，表明酸枣仁皂苷A在0.005～0.2 mg/ml范围内具有良好的线性关系。

3.3精密度试验精密吸取对照品溶液10 μl，分别连续进样6次，结果对照品溶液峰面积的RSD为3.68%（n=6）。

图2　HPLC色谱图

3.4稳定性试验精密吸取对照品溶液10 μl，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h和12 h进行测定。结果对照品溶液峰面积的RSD为3.51%（n=6），表明12 h内测定结果基本稳定。

3.5重复性试验取同一样品5份，每份1 g，精密称定，按“2.2”项方法制备溶液，分别进样，进样量为10 μl，测定5个结果，平均含量为0.12 mg/ml，RSD为3.39%（n=5）。

3.6加样回收试验精密量取已知含量样品溶液0.8 ml，加入0.1 ml对照品溶液（1 mg/ml），摇匀，进样10 μl进行测定，平行测定6份。计算平均回收率，结果平均回收率为98.64%，RSD=2.05%（n=6）。说明该方法测定结果准确。具体结果见表7。

表7　加样回收实验测定结果

3.7样品含量测定精密吸取样品溶液10 μl，依照上述色谱条件进行测定，每个样品平行测定3次，扣除含水量得蜜枣仁中酸枣仁皂苷A的含量为0.063%。结果见表8。

4　小结

本实验分别采用HPLC-UV和HPLC-ELSD法测定了福州特色饮片蜜炙酸枣仁中酸枣仁皂苷A的含量，结果显示

表8　样品含量测定结果　（n＝3）

样品在同一方法处理的情况下，两种检测方法测定酸枣仁皂苷A的含量结果相近。但HPLCELSD法的重复性和精密度等更好，而HPLC-UV法由于吸收度低，峰面积相对较小和相邻色谱峰的干扰而存在一定误差，如精密度、重复性实验RSD稍大。因此，笔者建议首选HPLC-ELSD法测定蜜炙酸枣仁中酸枣仁皂苷A的含量，如需用HPLC-UV法，可将样品液萃取后再进行测量，避免干扰。本研究可为蜜炙酸枣仁的质量控制提供参考。

［1］王茜，张艳强，杨艳婷，等.酸枣仁的化学成分及应用研究进展［J］.黑龙江中医药，2015，28（2）:259-261.

［2］福建省卫生厅.福建省中药炮制规范［M］.福州:福建科学技术出版社，1988:498.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:343-344.

［4］娄燕，贾英，何博赛，等.RP-HPLC双波长法同时测定酸枣仁汤中5种成分的含量［J］.沈阳药科大学学报，2013，30 （7）:537-540.

［5］崔思娇，罗洁，马天成，等.酸枣仁的超高效液相色谱指纹图谱［J］.中国药学杂志，2013，48（7）:509-511.

（编辑陈明伟）

R284.1

A

2095-4441（2015）04-0068-04

2015-08-27

福建中医药大学校管重点学科专项课题（编号:X2014106）

隋利强（1981-），男，福建福州市人，硕士，讲师，研究方向:中药炮制原理研究