GWAS识别的rs2107595多态性与缺血性中风气虚血瘀证的关联研究

申婷婷，古　联，陈　清，梁宝云，严　雁

（1.广西中医药大学，广西 南宁　530001；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁　530023）

临床报道

GWAS识别的rs2107595多态性与缺血性中风气虚血瘀证的关联研究

申婷婷1，古联2，陈清2，梁宝云2，严雁2

（1.广西中医药大学，广西 南宁530001；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁530023）

［目的］探索rs2107595多态性与中国南方汉族人缺血性中风气虚血瘀证的发生及血脂水平的关联。［方法］选取缺血性中风气虚血瘀证患者284例、对照组605例，采用Sequenom基因分型技术对rs2107595多态性进行基因分型，运用PLINK统计软件分析基因型与缺血性中风气虚血瘀证的发生及其血脂水平间的遗传关联。［结果］rs2107595多态性与缺血性中风气虚血瘀证的发生无显著关联（均P＞0.05），而与缺血性中风气虚血瘀证患者血清总胆固醇的关联具有统计学意义（加性模型：P=0.035）。［结论］GWAS识别的遗传变异rs2107595多态性可能影响缺血性中风气虚血瘀证患者的血脂代谢。

rs2107595；缺血性中风；气虚血瘀证；血清血脂水平

缺血性中风病性为本虚标实，其病因复杂，有风、火、痰、瘀、气、虚之分。现代遗传学研究证实了遗传因素对缺血性中风的发生具有重要作用［1］。2012年，Traylor等［2］的全基因组关联研究（GWAS）报道了rs2107595多态性与欧洲人大动脉粥样硬化型脑卒中的发生关联达到GWAS显著水平（P＜1× 10-8）。2014年，另一项跨疾病GWAS研究［3］也报道了欧洲人群中rs2107595多态性与缺血性中风的易感性显著关联，表明rs2107595多态性可能影响缺血性中风的发生。本研究旨在探讨GWAS识别的rs2107595多态性与中国南方汉族人缺血性中风气虚血瘀证的发生及其血脂水平的相关性。现报道如下。

1　资料与方法

1.1研究对象观察组284例缺血性中风气虚血瘀证患者来自于2009年7月～2014年6月广西中医药大学第一附属医院神经内科收治的住院患者，其中男142例，女142例，年龄66.99±10.45岁；对照组来源于同时期本院体检中心的健康体检者、骨科患非神经系统疾病且病情轻微者共605例，其中男327例，女278例，年龄65.56±12.45岁。观察组与对照组在性别、年龄分布方面均无显著性差异（P＞0.05），具有可比性。所有纳入对象均自我报告为广西汉族人，且无血缘关系，并签署知情同意书。

1.2纳入、排除标准观察组患者的纳入均符合缺血性中风的中、西医诊断标准。西医诊断根据1995年全国第四届脑血管学术会议《各类脑血管疾病诊断要点》［4］，所有缺血性中风患者均经头颅CT和/或MRI确诊；中医诊断根据《中风病诊断与疗效评定标准》［5］对中风患者进行辨证分型。中风气虚血瘀证的主症:半身不遂，口舌斜，言语謇涩或不语，感觉减退或消失；次症:面色白，气短乏力，自汗出，舌质暗淡，舌苔白腻或有齿痕，脉沉细。观察组中排除因脑外伤、肿瘤、心脏源性栓塞、短暂性脑缺血发作、脑血管畸形等引起的缺血性中风；排除具有自身免疫性疾病及合并严重心、肝、肾功能障碍等患者。对照组病史中无冠心病、脑梗死等心脑血管疾病，身体各系统未发现重大疾病，且近期无激素、免疫抑制剂治疗史。

1.3检测方法于次日清晨采集受试者空腹外周血5 ml两管，分装为1管抗凝血、1管非抗凝血。抗凝血置于4℃冰箱保存，于1周内提取血液基因组DNA。基因组DNA的提取应用北京天根科技有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒［TIANamp Blood DNA Kit（离心柱形）］从人血白细胞中提取，其提取过程严格按照产品说明书操作步骤进行，将提取出的基因组DNA置于-80℃保存备用。本研究的引物设计、引物合成及基因分型检测等实验过程主要由博淼生物科技（北京）有限公司严格按照实验操作规程完成:引物设计使用Sequenom Assay Designer 3.1软件（Sequenom，San Diego，CA，USA）进行设计，引物序列为:正义链:5'-ACGTTGGATGCATTGAGAAGGATGAGGAGC-3'；反义链:5'-ACGTTGGATGTTTGTGTGCTTGTACATTC-3'；采用Sequenom Mass ARRAY iPLEX平台进行基因分型检测。此外，1管非抗凝血用于患者血清血脂水平［包括总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）］的检测，采用HITACHI日立7600全自动生化分析仪测定。

1.4统计学方法运用PLINK统计软件分析rs2107595多态性基因型与缺血性中风气虚血瘀证及其血脂水平之间的遗传关联:Hardy-Weinberg平衡分析采用拟和优度χ2检验；各基因型与缺血性中风气虚血瘀证的关联应用非条件Logistic回归模型分析，其关联强度以比值比（OR）及95%置信区间（CI）表示；采用一般线性回归分析位点与血清血脂水平的关联。另外，采用SPSS16.0软件对性别、年龄等一般资料进行组间比较:计数资料组间比较采用χ2检验，计量资料组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1基因型、等位基因型分布及Hardy-Weinberg平衡检验

见表1。Hardy-Weinberg平衡检验结果显示:在对照组中，rs2107595多态性的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（P=0.927）。χ2检验结果显示:在缺血性中风气虚血瘀证的观察组与对照组间，rs2107595多态性的基因型、等位基因型分布无统计学差异（均P＞0.05）。

表1　rs2107595多态性的基因型、等位基因型分布

2.2rs2107595多态性与缺血性中风气虚血瘀证的关联分析

见表2。rs2107595多态性与缺血性中风气虚血瘀证的关联无统计学意义（各遗传模型均P＞0.05），在调整年龄、性别因素后，其关联亦无统计学意义（各遗传模型均P＞0.05）。

表2　rs2107595多态性与缺血性中风气虚血瘀证的关联

2.3rs2107595多态性与缺血性中风气虚血瘀证血脂水平的关联分析见表3。rs2107595多态性与缺血性中风气虚血瘀证患者的血清TC水平显著关联（加性模型:β=-0.13，OR= -0.25～-0.01，P=0.035），而与气虚血瘀证患者的血清TG、HDL-C、LDL-C水平之间的关联无统计学意义（均P＞0.05）。

表3　rs2107595多态性与缺血性中风气虚血瘀证血脂水平的关联

3　讨论

《素问·调经论篇》第六十二篇曰“血气不和，百病乃变化而生”，指出气血不和是疾病发生的基础。有学者［6］认为中风病的发生，即是在气血内虚的基础上，遇忧思劳倦、嗜食厚味、烟酒等诱因，引起脏腑阴阳失调、气血逆乱所致的一种疾病。《金匮要略·中风历节病脉证并治》也提出正气亏虚则脉络空虚，风邪乘虚入中，致使经脉阻滞而引发中风。清·王清任《医林改错》云“元气既虚，必不能达于血管，血虚无气，必停留而瘀”，亦认为气虚可导致血瘀，继而相兼为病的学术观点。鲍远程等［7］探讨了缺血性中风的证候特点，明确指出气虚、血瘀是缺血性中风的最常见证候要素。可见，气虚是中风病发生的根源，血瘀则是其核心［8］。有鉴于此，本研究主要针对气虚血瘀型缺血性中风进行分析，探讨其与GWAS识别的遗传变异rs2107595多态性的遗传关联，为缺血性中风中医证候的现代发病机制提供分子生物学依据。

GWAS在全基因组范围内分析遗传变异与表观特征的关系［9］，具有样本量大、算法严格、重复验证的特点，可有效地识别复杂疾病的常见遗传变异。目前，在阿尔茨海默病、糖尿病、前列腺癌、肺癌等一系列复杂疾病中进行的GWAS较多，而关于中风的GWAS开展尚少，但均成功发现了疾病相关的风险位点。需注意的是，由于复杂疾病本身具有遗传异质性，且其发生机制在不同人群中也存在种族差异，所以某一种族人群GWAS所发现的阳性关联仍需在不同种族人群中进行验证。本研究即是对既往欧洲人GWAS［2-3］识别的易感位点在中国人群中的进一步验证，结果显示中国南方汉族人rs2107595多态性与缺血性中风气虚血瘀证的发生风险无显著关联。根据HapMap数据库的最小等位基因频率（MAF）数据，显示rs2107595多态性分别在欧洲人群、中国人群的MAF 为0.200、0.311，可见该位点的等位基因频率分布存在一定的种族差异。此外，由于受到样本量的限制，不能提供足够高的检验效能，从而产生不一致的易感性关联结果，故仍需在不同种族人群扩大样本进一步验证。

现代医学认为，血脂代谢异常是脑动脉粥样硬化发生的关键，动脉粥样硬化则是中风发生的病理基础，血脂异常被认为是中风发生的重要危险因素。本研究分析了rs2107595多态性与缺血性中风气虚血瘀证的血脂水平关联，结果显示该位点与中风气虚血瘀证患者的血清TC显著关联，提示rs2107595可能参与影响中风气虚血瘀证的脂质代谢过程。Markus等［10］的研究表明rs2107595多态性与颈动脉斑块形成相关联，且在动脉粥样斑块中表达上调。Azghandi等［11］的研究亦显示rs2107595多态性参与影响动脉粥样硬化的发生。由此可知，rs2107595多态性影响动脉粥样硬化的发生，而其原因则可能是该位点通过参与脂质代谢紊乱的病理过程而形成。中医学认为，中风气虚血瘀证与血脂水平具有密切的关联。《直指方》云“气为血帅，气行则血行，气止则血止”，指出气血在生理、病理上的关系，认为气为血之统帅，气能行血，反之气的功能障碍如气虚或气滞，则常引起血行不利，易致血瘀。而中医之“血瘀”是血脂代谢异常的主要证候特点之一，且其血液流变学改变明显。元光锋［12］观察了不同证型中风患者血脂水平变化情况，结果发现气虚血瘀型中风患者的血清TC、TG水平均显著增高。吴玲等［13］探讨了缺血性中风恢复期不同证型之间的血脂水平差异，显示中风气虚血瘀证患者的血清TC水平显著高于其他证型。黄晓［14］研究也显示缺血性中风气虚血瘀证患者的血脂、血液流变学变化异常。目前有关基因多态性与缺血性中风气虚血瘀证的血脂关联研究尚未见报道，但已有研究报道遗传变异与中风脂质代谢相关［15］。本研究发现GWAS识别的rs2107595多态性可能影响缺血性中风气虚血瘀证的血脂代谢，但还需进一步开展多中心、大样本研究进行验证。

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［13］吴玲，刘兰英.缺血性脑卒中恢复期不同证型血脂差异对复发的影响研究［J］.检验医学与临床，2010，7（24）: 2721-2722.

［14］黄晓.缺血性中风（中经络）证候分类与血脂、血压、血液流变学关系的研究［J］.中国中医急症，2002，11（1）:32-33.

［15］龙显科，王俊利，潘国刚，等.整合素-α2和-β3基因多态性与缺血性脑卒中的相关性研究［J］.中国实验诊断学，2010，14（8）:1234-1237.

（编辑陈明伟）

Association Study on rs2107595 Polymorphism Identified by GWAS and Ischemic Stroke of Qi Deficiency and Blood Stasis

SHEN Ting－ting1，GU Lian2，CHEN Qing2，LIANG Bao－yun2，YAN Yan2
（1.Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi，530001；2.The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi，530023）

［Objective］To explore the association between rs2107595 polymorphism and occurrence as well as blood lipid levels of ischemic stroke of qi deficiency and blood stasis pattern in the people of Han nationality of Southern China.［Methods］284 cases of ischemic stroke of qi deficiency and blood stasis pattern and 605 healthy controls was selected.Sequenom MassArray genotyping technique was conducted on rs2107595 polymorphism.PLINK statistical software was applied to analyze genetic association between genotype and occurrence as well as blood lipid levels of ischemic stroke of qi deficiency and blood stasis pattern.［Results］There was no significant association between rs2107595 polymorphism and occurrence of ischemic stroke of qi deficiency and blood stasis pattern.While rs2107595 polymorphism was associated with total serum cholesterol of ischemic stroke of qi deficiency and blood stasis patients statistically（additive model:P=0.035）.［Conclusions］Genetic variation in rs2107595 polymorphism may affect the blood lipid metabolism of ischemic stroke of qi deficiency and blood stasis patients.

rs2107595；ischemic stroke；qi deficiency and blood stasis pattern；serum lipid levels

R743.3

A

2095-4441（2015）04-0005-04

2015-10-22

国家自然科学基金资助项目（编号:81260594）；国家自然科学基金资助项目（编号:81473670）；广西自然科学基金项目（编号:2013GXNSFAA019145）

古联，E-mail:gulian2012@163.com