积雪草苷对兔耳增生性瘢痕组织中胶原纤维及TGF-β1表达的影响

周忠志，熊　武，黄新灵，杨双喜，向聪莲，陈丽

（1.湖南中医药大学第一附属医院烧伤疮疡整形外科湖南长沙410007；2.湖南中医药大学湖南长沙410208）

积雪草苷对兔耳增生性瘢痕组织中胶原纤维及TGF-β1表达的影响

周忠志1，熊武1，黄新灵1，杨双喜1，向聪莲1，陈丽2

（1.湖南中医药大学第一附属医院烧伤疮疡整形外科湖南长沙410007；2.湖南中医药大学湖南长沙410208）

目的：探讨积雪草苷用于兔耳增生性瘢痕后对胶原纤维组织结构形态的改变和TGF-β1表达水平的影响。方法：健康成年日本大耳白兔20只，随机分为实验组（高中低浓度积雪草苷治疗）和对照组（生理盐水、模型），共5组，且均通过手术制成兔耳瘢痕模型。术后21d形成成熟的兔耳瘢痕模型，实验组和生理盐水组分别早晚各一次局部注射高浓度积雪草苷1 000mg/ml、中浓度500mg/ml、低浓度250mg/ml和0.9%NaCl 0.2ml，空白对照组不做任何处理。用药后28d切取标本，采用测微尺、瘢痕硬度精密测定仪测量瘢痕和正常兔耳皮肤厚度和硬度，光镜下观察苏木精-伊红染色、Masson三色法胶原染色的组织结构变化情况；采用免疫组织化学法检测瘢痕和正常皮肤组织中TGF-β1表达的变化。结果：与模型组相比，积雪草苷组瘢痕组织增生层明显比模型组薄，且未见丰富的血管和炎细胞，胶原纤维减少，排列稀疏，TGF-β1表达下降，且表现出一定的浓度依赖性。结论：积雪草苷可明显抑制增生性瘢痕，其抗瘢痕的作用可能通过降低TGF-β1的表达有关。

积雪草苷；增生性瘢痕；胶原纤维；TGF-β1；兔耳瘢痕模型

增生性瘢痕多发于损伤深度累及真皮的创伤，与正常瘢痕相比增生性瘢痕形成过程中成纤维细胞增殖更活跃，胶原蛋白沉积更明显，导致真皮纤维化更为显著［1］。增生性瘢痕是整形修复外科医师面临世界性难题，目前临床上治疗增生性瘢痕方法多种多样，其中主要的治疗方法包括手术、药物、机械压迫、放射、激光及射频等方面，虽然疗效已有较大进展，但与理想中的瘢痕治疗还是差距较大。在缺乏十分有效的瘢痕防治方法的背景下，挖掘毒性较低的天然药物或提炼出其活性成分用于增生性瘢痕的预防和治疗成为目前抗瘢痕研究的热点，已在相关领域取得了突破性进展。积雪草苷是伞形科植物积雪草中活性成分，经提炼而得到的一种三萜类化合物，具有明显抗纤维化、抗氧化和促进伤口愈合等药理作用，临床上使用积雪苷抗瘢痕形成或增生疗效肯定，已广泛用于深度烧烫伤愈合后瘢痕［2］。诸多研究表明调控转化因子（TGF）-β1在瘢痕增生过程中扮演着重要角色。本实验将积雪草苷配成不同浓度后对兔耳增生性瘢痕进行局部注射，通过苏木精-伊红（HE）染色和马松（Masson）染色观察其组织结构形态，用免疫组织化学法检测瘢痕和正常皮肤组织中TGF-β1表达，进一步研究积雪草苷抗瘢痕的作用与TGF-β1的关系。

1　材料和方法

1.1实验器材

清洁级日本大耳白兔20只，雄性，体重2.5～3.0kg（湖南中医药大学动物室）。积雪草苷干粉（上海医药工业研究所）；苏木精、伊红，Masson染色试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）；TGF-β1单克隆抗体试剂盒（上海恒远生物科技有限公司）；生物光学显微镜（宁波北仑方远光电仪器有限公司）；测微尺（上海光学仪器厂）；瘢痕硬度精密测定仪（重庆里博仪器有限公司）；常规组织切片制作及病理染色全套等设备。

1.2方法

1.2.1兔耳瘢痕模型的建立与给药

日本大耳白兔20只，分为实验组和对照组。实验组再细分为高中低三种积雪草苷不同浓度梯度组；对照组则细分为模型组和空白对照组。实验组和对照组兔耳腹面剃毛，硫化钠脱毛，戊巴比妥钠（30mg/kg）静脉注射麻醉。兔耳区备皮后，常规络合碘消毒，铺无菌巾单。麻醉满意后，在严格无菌操作下，避开大血管，沿兔耳腹侧中段长轴，去除全层皮肤及软骨膜，保留软骨，制成直径为1cm大小的圆形创面。每侧兔耳分别制得4个创面，相连创面间隔在1cm以上。创面成功制成后用无菌生物通透性薄膜覆盖以预防感染。术后21d左右创面完全愈合，均去上皮化，此时形成成熟兔耳瘢痕模型［3］。实验组和模型组早晚皮下注射药物，空白对照组不做任何处理。将积雪草苷干粉分别制备成1 000mg/ml、500mg/ml和250mg/ml高中低三种浓度梯度的注射液，现备现用，于早晚8点两次分别注射于对应实验组兔耳瘢痕，每次0.2ml；同理将0.9%Nacl注射于模型组兔耳瘢痕中，每次0.2ml。用药后28d后处死动物，切取标本，收集各组动物瘢痕组织及对应部位正常组织。采用瘢痕硬度精密测定仪测量瘢痕和正常兔耳皮肤厚度和硬度。用测微尺测量兔耳瘢痕最高点至耳软骨表面的垂直厚度（a）、瘢痕周边正常皮肤至耳软骨表面的垂直厚度（b），计算得出瘢痕增生指数（HⅠ=a/b）。标本中的一部分用甲醛固定，用以做成石蜡切片病理检测；另一部分低温冻存，用做TGF-β1蛋白免疫组织化学法检测。

1.2.2HE和Masson染色

瘢痕石蜡切片，脱蜡后先用用苏木精染液5min，再用自来水蓝化10min，最后通过伊红染色30s，风干后制成中性树胶封片，烘干，用光学显微镜观察并摄片。同理Masson三色法胶原染色采用相应的方法进行染色，光学显微镜观察并摄片。

1.2.3免疫组织化学法检测

冷冻兔耳瘢痕和周边正常皮肤组织，采用TGF-β1单克隆抗体试剂盒检测瘢痕和正常皮肤组织中TGF-β1的表达。TGFβ阳性细胞半定量（参照徐少骏［4］方法），玻片放置在相同强度光线下观察，按标本染色的深浅（信号强度）分为3级：棕黑色为强阳性，记作“+++”，棕黄色为阳性，记作“++”，浅棕色为弱阳性，记作“+”。实验中于表皮随机选取5个位置，每个位置根据组织厚度从表皮至真皮层依次取4～6个高倍视野，每个视野随机观察细胞数50个。将实验中观察到的阳性细胞选定在各个不同级别中，用权重方法予以量化，即“+++”乘3，“++”乘2，“+”乘1。权重量化的数反映了该位置的信号强度，且通过选取5个位置算得的平均值作为该标本的相对信号强度来进行对比和统计分析。

1.2.4数据统计与分析

采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行t检验，所有数据采用x±s表示，P＜0.01为差异有统计学意义。

2　结果

2.1兔耳瘢痕组织形态特征

兔耳腹侧面形成创面后约13～14d后，伤口结痂脱落基本愈合，此时能明显触到硬结。术后21～22d，创口硬结更加明显，呈淡红色改变，突出于兔耳正常皮肤厚度约为其2倍，但其增生范围局限于原创口内。模型组在上皮化后第6周左右瘢痕增生达到最高峰，此时瘢痕的厚度约为兔耳腹面皮肤厚度的3倍。HE染色见模型组真皮组织明显增生变厚，增生瘢痕由大量成纤维细胞、胶原纤维及新生血管组成，大量炎性细胞浸润；胶原排列紊乱而极其不规则，呈结节状或旋涡状分布，且随着时间推移变化不明显（见图1）。Masson染色显示，瘢痕组织中饱含粗大而紊乱排列的胶原纤维细胞和胶原蛋白（见图2）。

2.2积雪草苷对兔耳增生性瘢痕组织学改变

实验组随着给药时间的推移，瘢痕逐步变软，且体积缩小，趋于平复，色变淡。HE染色示瘢痕组织内血管、成纤维细胞和胶原纤维逐渐较少，瘢痕呈淡红色，胶原纤维稀疏，排列较整齐，未见丰富的炎性细胞，且在一定浓度范围内呈浓度依赖性改变，即浓度越高改变越明显。Masson染色显示瘢痕组织中胶原纤维增生明显改善，病理检测结果表明，积雪苷霜治疗可显著改善瘢痕组织结构，两者均显示出一定的浓度依赖性。（见图2）

2.3瘢痕增生指数HⅠ

表2　各实验组与模型组中TGFβ1表达的相对信号强度对比研究

实验组瘢痕均比模型组厚度薄，模型组HⅠ值平均约4.38±0.20，高中低浓度实验组HⅠ值分别为：2.34±0.13、2.62±0.15、2.88±0.16，HⅠ值差异有统计学意义（P＜0.01）（见表1）。

图3　显示的是TGFβ1阳性颗粒表达，实验组TGFβ1阳性颗粒表达强度较模型组和生理盐水组低

2.4积雪草苷对兔耳增生性瘢痕TGF-β1表达的影响TGFβ1蛋白呈阳性表达的棕黄色颗粒主要分布于成纤维细胞及上皮基底层细胞。实验组、模型组增生性瘢痕组织中TGFβ1的表达情况见表2。从表中的数据可知，实验组TGFβ1阳性颗粒表达强度较模型组低，差异有统计学意义（P＜0.01）（图3）。

3　讨论

3.1胶原纤维在瘢痕形成中所扮演的角色

瘢痕的形成是高等哺乳动物出生后在创伤修复过程中自我修复愈合的表现形式，有着极为复杂的修复机制。瘢痕形成过程中成纤维细胞大量增生和胶原蛋白过度沉积将导致病理性瘢痕的发生。增生性瘢痕是皮肤损伤后机体过度修复而表现出的一种病理状态，伴有大量的胶原蛋白沉积［5］。研究表明成纤维细胞是创伤愈合过程中的主要修复细胞，在创伤修复过程中对诱导细胞增殖、细胞因子产生和胶原蛋白合成起重要作用［6］。而胶原蛋白纤维则是构成组织修复最重要的细胞外基质，对创伤修复的完成起着举足轻重的作用。胶原蛋白纤维产生于创伤修复的整个过程中，是瘢痕形成的关键性因素。生理情况下，伤口愈合过程中初期形成的成纤维细胞和其分化而来的具有收缩特性的肌成纤维细胞会逐渐凋亡消失；病理条件下，肌成纤维细胞功能发生变异，产生大量的胶原纤维并沉积［7］。肌成纤维细胞持续存在并发生异常的功能，最终导致增生性瘢痕的形成。本实验通过去除兔耳腹侧面全层皮肤及软骨膜而制作成成熟稳定的兔耳增生性瘢痕模型，并通过局部注射积雪草苷对瘢痕进行治疗，组织病理学检测表明，积雪草苷能明显抑制真皮层纤维增生和血管生成，抑制胶原纤维的合成，从而抑制瘢痕增生。

3.2TGF-β的表达与瘢痕增生的关系

目前已知在创伤愈合过程中具有抗炎和促炎双重活性的转化生长因子（TGF-β）起了至关重要的作用，参与了创伤修复的全过程［8］。TGF-β是TGF家族中最主要的促进瘢痕纤维化形成的细胞因子，若TGF抗炎和促炎双重活性失衡，瘢痕组织将过度增生，表现出过度纤维化。TGF具有调节细胞增殖分化、结缔组织生物合成等功能，是促进细胞增殖分裂的强效分裂和分化剂，在细胞的形态变化、增殖分化过程中扮演重要的角色，有利于细胞自身修复和胚胎发育。在瘢痕增生过程中，TGF通过刺激成纤维细胞的分化、转化及增生；调节细胞的粘附和肉芽组织的退化，及细胞外基质的合成与沉积；同时抑制胶原酶的产生，且在一定程度上增加胶原酶抑制剂和a2巨球蛋白组织抑制剂的含量，使瘢痕组织持续增生，过度纤维化［9］。

在创伤修复过程中，TGF-β对胶原的合成和降解以及肉芽组织被结缔组织取代的过程中起着重要的调节作用。TGF-β通过旁分泌和自分泌直接或间接作用于创口修复细胞，产生细胞的趋化性迁移、增生分化，细胞外基质合成及分泌三大类重要的生物学效应。对TGF-β的研究进一步表明，TGF-β既可通过直接作用于成纤维细胞，增加成纤维细胞合成大量的细胞外胶原基质，又可通过直接作用于单核一巨噬细胞、内皮细胞和肥大细胞等，上述细胞可进一步对成纤维细胞的影响而发挥作用［10］。同时TGF-β还可通过增强纤维结合蛋白及其受体、各种胶原及蛋白酶抑制剂等不同细胞外基质的基因表达上调而发挥作用。

3.3积雪草苷抑制兔耳增生性瘢痕的作用机制探讨

积雪草苷是从积雪草中提取出的一种白色针状结晶，是积雪草最主要的成分。现代药理研究认为积雪草苷具有促进伤口愈合、抗炎、抑制病理性瘢痕增生以及恢复神经功能等多种药理活性。目前在临床上，积雪草苷用于治疗多种皮肤疾病，如皮肤溃疡、局限性硬皮病以及瘢痕疙瘩等，且大量的临床实践已经证实外用积雪草苷对人增生性瘢痕疗效确切，阐明其作用机制将为临床治疗提供有力的依据。

TGF-β1是转化生长因子（TGF-β）中的典型代表，在瘢痕增生过程中起重要的作用。大量研究表明TGF-β1通过激活由Smad介导的信号传导通路完成多种生物学活性［11］。本实验研究发现积雪草苷能改变增生性瘢痕的形态，及下调TGF-β1的表达，实验组的成纤维细胞由长梭形变为圆形，充分说明积雪草苷能够抑制成纤维细胞的生长，且不同浓度的积雪草苷进一步证实在一定浓度范围内随着时间的推移和浓度的增高抑制瘢痕的作用增强。通过目前的实验我们有理由推断，积雪草苷可能是通过激活TGF-β/Smad通路完成生物活性，其发挥效应的代谢调节通路有待进一步研究。

4　结论

创面修复和瘢痕形成机制是一个十分复杂的生物学过程，瘢痕形成的确切机制目前学术界尚未完全阐述清楚。积雪草苷在抑制增生性瘢痕方面显示出独特的优势，已做成各种制剂广泛应用于临床，其抑制瘢痕的作用可能通过降低TGF-β1的表达有关，且表现出一定的浓度依赖性。

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编辑/张惠娟

Influences of asiaticoside on collagen fibers and TGF-β1 expressions in hypertrophic scar tissues of the rabbit ears

ZHOU Zhong-zhi1，XIONG Wu1，HUANG Xin-ling1，YANG Shuang-xi1，XIANG Cong-lian1，CHEN Li2
（1.Department of Burn and Plastic Surgery，The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410007，Hunan，China；2.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，Hunan，China）

Objective To explore the influences of asiaticoside on the morphology of collagen fibers and TGF-β1 expression in hypertrophic scar tissues of the rabbit ears.Methods A total of 20 healthy adult Japanese white rabbits were randomly divided into 5 groups:the experimental groups with high，medium and low concentration of asiaticoside respectively and the control groups（withnormal saline and model group）.Hypertrophic scar models were established in all of the rabbits.The experimental groups and normal saline group were locally injected with high（1 000mg/ml），medium（500mg/ml）and low concentration（250mg/ml）of asiaticoside and normal saline（0.9%NaCl），each of 0.2ml every morning and night.And the blank control group was not given any treatment.Specimens were taken at 28th day after medication，when the thickness and hardness of scar and normal rabbit ear skin were measured.Changes in tissue structure were observed with hematoxylin eosin staining and Masson staining under light microscope.Immunohistochemical method was used to detect the changes of TGF-β1 expressions in scar and normal skin tissues.Results Compared with the model group，the hyperplasia layer of the scar tissues were obviously thinner in the asiaticoside group，where the collagen fibers were decreased and arranged sparsely，without rich blood vessels and inflammatory cells；in addition，TGF-β1 expression was downregulated，showing certain concentration dependence.Conclusion Asiaticoside can obviously inhibit proliferative scar，the cause of which may be related with reducing the expression of TGF-β1.

asiaticoside；hyperplastic scar；collagen fibrils；TGF-β1；rabbit ear scar mode

R619+.6

A

1008-6455（2015）21-0032-06

湖南省科技厅科技计划项目（2012FJ3012）

陈丽，女，副教授，主要研究瘢痕的治疗和创面防治等；E-mail：1224909171@qq.com

2015-08-11

2015-10-29