芪龙益肾汤对糖尿病肾病大鼠血清Cys-c、HbAlc及umAlb水平的影响△

李委兄，许筠，翟晓丽，丁夏楠，李桂霞

(1.甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000；2.兰州市第二人民医院，甘肃 兰州 730000)

·基础研究·

芪龙益肾汤对糖尿病肾病大鼠血清Cys-c、HbAlc及umAlb水平的影响△

李委兄1，许筠2*，翟晓丽2，丁夏楠1，李桂霞1

(1.甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000；2.兰州市第二人民医院，甘肃 兰州 730000)

目的：观察芪龙益肾汤对糖尿病肾病大鼠的治疗作用。方法：将60只SPF级Wistar雄性大鼠称重，随机选10只为正常对照组，以普通饲料喂养。剩余大鼠以高脂高糖饲料喂养8周后，空腹12 h，给予小剂量链脲佐菌素(剂量为30 mg·kg-1)，腹腔注射，连续注射3 d。大鼠造模后称重，再随机将造模成功大鼠分为模型组、芪龙益肾汤高、中、低剂量组(剂量分别为每天25.2、12.6、6.3 g·kg-1)、厄贝沙坦组，每组9只。给药干预治疗8周后，将各组大鼠置于代谢笼中，收集24 h尿量，测定尿微量白蛋白(umAlb)。麻醉取血，分离血清，测定胱抑素C(Cys-c)、糖化血红蛋白(HbAlc)、空腹血糖(FPG)水平。结果：给药8周后，与正常对照组比较，模型组大鼠血清Cys-c、HbAlc、FPG及umAlb水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，芪龙益肾汤中、高剂量组及厄贝沙坦组大鼠血清Cys-c、HbAlc、FPG及umAlb水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：芪龙益肾汤能降低早期糖尿病肾病大鼠的血清Cys-c、HbAlc、FPG及umAlb表达水平，改善肾功能。

糖尿病肾病；芪龙益肾汤；胱抑素C；糖化血红蛋白；尿微量白蛋白

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见的微血管并发症，其病理改变主要是毛细血管基底膜增厚及系膜基质增生，最终导致肾小球硬化。目前，糖尿病肾病在欧美位居终末期肾病的首位[1]，在我国也上升至终末期肾病的第2位，约占总终末期肾病的25%[2]，而且目前仍然有上升的趋势。近年来的研究发现，胱抑素C(Cys-c)、糖化血红蛋白(HbAlc)及尿微量白蛋白(umAlb)水平可以作为诊断早期DN的重要指标，联合检测三者对早期DN的诊断具有重要意义[3]。早期DN可归属中医学“消渴”的范畴，其临床表现以气阴两虚、瘀血阻络为多见[4]。中药复方芪龙益肾汤是翟晓丽主任医师在兰州大学第二人民医院刘宝厚教授多年临床经验基础上总结而来的方药，具有益气养阴、活血化瘀之功能，在临床上己使用多年，取得了良好的疗效。本研究采用链脲佐菌素注射造成大鼠DN动物模型，旨在通过观察芪龙益肾汤对DN大鼠Cys-c、HbAlc及umAlb等指标的影响，来进一步证实中药复方芪龙益肾汤可以起到保护糖尿病患者肾脏的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

动物：SPF级Wistar雄性大鼠60只，由甘肃中医学院实验中心提供，体重为(200±20) g/只，动物使用许可证号为SCXK(甘)2011-0001。本研究经甘肃中医学院实验伦理委员会同意。

芪龙益肾汤处方由生黄芪30 g、生地黄10 g、干地龙10 g、太子参15 g、玄参15 g、丹皮10 g、丹参10 g、天花粉15 g、茯苓15 g、甘草10 g组成，加1000 mL水，浸泡30 min，煮沸30 min，过滤取汁；再加1000 mL水，煮沸30 min，过滤取汁，合并2次药液。水浴浓缩成每1 mL含2 g生药的药液，高压灭菌，置4 ℃冰箱保存，备用(原生药由甘肃中医学院附属医院药房提供)；厄贝沙坦片[赛诺菲(杭州)制药有限公司，国药准字 H20040494]；链脲佐菌素(STZ，美国 SIGMA)；大鼠代谢笼(意大利Tecniplast)；大鼠胱抑素-C测定试剂盒(美国R&D公司)；大鼠微量白蛋白测定试剂盒(美国Bethyl公司)；糖化血红蛋白测定试剂盒(美国Helena)；ACCU-CHEK血糖仪(德国罗氏)。

1.2 方法

1.2.1 分组、造模 将60只大鼠称重，随机选10只为正常对照组，以普通饲料喂养。剩余大鼠以高脂高糖饲料喂养8周后造模，称重(除去死亡等不合格大鼠5只)，再随机将造模大鼠分为模型组、芪龙益肾汤高、中、低剂量组(剂量分别为每天25.2、12.6、6.3 g·kg-1)、厄贝沙坦组，每组9只。

模型组及其他各治疗组大鼠空腹12 h后给予小剂量链脲佐菌素(30 mg·kg-1，溶入PH为4.5的0.1 mol·L-1柠檬酸缓冲液中)，腹腔注射，连续注射3 d。造模完成72 h后，经尾静脉采血测血糖。测随机血糖，血糖值≥16.7 mmol·L-1为Ⅱ型糖尿病；血糖值≥1次未达标者测空腹血糖FPG和葡萄糖耐量实验2 h血糖(实验前禁食12 h，空腹尾尖取血，测FPG，继以2 g·kg-1葡萄糖灌胃，于120 min时取血测血糖)，FPG≥7.0 mmol·L-1和(或)2 h PG≥11.1 mmol·L-1者亦为Ⅱ型糖尿病大鼠。在STZ注射3周后，检测大鼠尿蛋白排泄率，若持续增加，则确定糖尿病肾病造模成功[5]。造模结束后，正常对照组剩余10只大鼠，模型组剩余8只大鼠，芪龙益肾汤高剂量组剩余8只大鼠，中剂量组剩余8只大鼠，低剂量组剩余7只大鼠，厄贝沙坦组剩余9只大鼠。各组大鼠数量减少的原因主要为造模技术不熟练或造模不成功等。

1.2.2 给药 各治疗组处方量均按照《中药药理研究方法学》中，人与实验动物体表面积折算等效剂量比换算。芪龙益肾汤各组大鼠分别按相应剂量灌胃给药；厄贝沙坦组每天按12.6 mg·kg-1剂量灌胃；正常对照组、模型组大鼠每天灌胃等容量0.9%氯化钠溶液，连续治疗8周。治疗结束后，正常对照组剩余10只大鼠，模型组剩余6只大鼠，芪龙益肾汤高剂量组剩余7只大鼠，中剂量组剩余8只大鼠，低剂量组剩余6只大鼠，厄贝沙坦组剩余8只大鼠。此次大鼠数量减少的原因主要为高血糖引起的代谢紊乱，导致脏器衰竭等。

1.2.3 检测指标 造模3周后，各组大鼠尾尖取血，同时留取24 h尿，对指标进行检测；给药8周后留取24 h尿，行股动脉取血，并处死大鼠，对指标进行检测。血清胱抑素C 和umAlb采用 ELISA法，HbAlc采用亲和色谱微柱法，FPG采用罗氏血糖仪进行测定。

2 结果

2.1 芪龙益肾汤对糖尿病肾病大鼠一般情况的影响

造模后大鼠与正常对照组相比逐渐出现多饮、多尿、多食、体重减轻、毛发枯黄无光泽等症状。各治疗组给药8周后与模型组比较，大鼠精神状态好、竖毛较少、活动较好。

2.2芪龙益肾汤对DN大鼠血清Cys-c及umAlb水平的影响

给药8周后，与正常对照组比较，模型组大鼠血清Cys-c及umAlb水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组大鼠比较，芪龙益肾汤低、中、高剂量组大鼠血清Cys-c及umAlb水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。而芪龙益肾汤中、高剂量组及厄贝沙坦组血清Cys-c及umAlb水平降低更明显，差异有统计学意义(P<0.01)；与造模3周后比较，给药8周后芪龙益肾汤中、高剂量组及厄贝沙坦组大鼠血清Cys-c及umAlb水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清CysC、umAlb水平的比较

注:与正常对照组比较,aP<0.01；与模型组比较,bP<0.05，cP<0.05，dP<0.05；与芪龙益肾汤低剂量比较，bP<0.05；与治疗前比较，bP<0.05，cP<0.05，dP<0.05。

2.3芪龙益肾汤对糖尿病肾病大鼠FPG、HbAlc水平的影响

给药8周后，与正常对照组比较，模型组大鼠FPG、HbAlc明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组大鼠比较，芪龙益肾汤中、低剂量组大鼠FPG、HbAlc明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，芪龙益肾汤高剂量组与厄贝沙坦组降低大鼠FPG、HbAlc作用更明显，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠血清FPG、HbAlc水平的比较

注：与正常对照组比较,aP<0.05；与模型组比较,bP<0.05，cP<0.05；与厄贝沙坦组比较，bP<0.05；与芪龙益肾汤低剂量比较，bP<0.05；与治疗前比，bP<0.05，cP<0.05。

3 讨论

Cys-c是一种分泌性低分子蛋白，由于其产生速率恒定，几乎全部由肾小球滤过，是测定肾小球滤过功能较理想的检测指标[6]。Cys-c也是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族成员，存在于所有细胞核中，生成速度恒定，血浓度稳定，不易受其他炎症、免疫等因素的影响，且肾脏是其唯一的代谢及滤过的器官。Cys-c是一种反映肾小球滤过率的理想指标，不仅可以作为早期肾脏损害的标志，而且可作为肾功能监测的标志[7]。umAlb属于肾小球性蛋白，是肾小球筛网选择性和电荷选择性屏障损伤的主要标志性蛋白，是判断肾小球受损程度的重要标志物，Ⅱ型糖尿病(T2DM)血糖控制不佳者，由于长期高血糖使肾小球基底膜增厚，肾小球处于高滤过状态，基底膜通透性增高，从而引起肾损害，最终导致大量umAlb在尿中排出。umAlb检测是目前临床用来监测T2DM早期肾损害的常规指标[8]。HbAlc量与血糖浓度呈正相关，其值反映患者体内取血前8～12周血糖总水平，通常约为3%～6%[9]。高血糖状态下 HbAlc生成变多，与氧合血红蛋白竞争携氧能力，加上高糖状态使血液黏稠度升高，导致微血管灌流不足、组织细胞缺氧，损伤内皮细胞，基底膜电荷屏障缺损，出现蛋白尿[10]。HbAlc代表患者体内的血糖水平，与糖尿病患者肾功能损害有相关性，其可作为判断有无肾功能损害及损害程度的指标[11]。目前Cys-c、HbAlc及umAlb作为诊断早期DN的重要指标，联合检测三者及FPG对中药复方芪龙益肾汤治疗DN大鼠也具有重要意义。

本研究用的中药复方芪龙益肾汤主要由生黄芪、生地黄、干地龙、太子参、玄参、丹皮、丹参、天花粉、茯苓等组成。方中生黄芪、太子参益气健脾，有复升清降浊之功；生地黄、玄参、山萸肉滋养阴精；天花粉、丹皮以助生地黄等养阴清热，防阴虚火旺；丹参、干地龙活血化瘀，通利瘀滞之脉管。诸药合用，共奏益气养阴、活血化瘀之功。

本研究发现，复方芪龙益肾汤高、中剂量组及厄贝沙坦组均能显著减少DN模型大鼠Cys-c、FPG、HbAlc及umAlb水平，且高剂量组与厄贝沙坦组疗效类似，证实了中药复方芪龙益肾汤可以起到保护糖尿病患者肾脏的作用，其作用机制尚待进一步研究。

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EffectofQilongyishenTangonLevelofSerumCys-c，HbAlcandumAlbinKidneyofRatswithDiabeticNephropathy

LIWeixiong1，XUJun2*，ZHAIXiaoli2，DINGXianan1，LIGuixia1

(1.GansuunivercityoftraditionalChinesemedicine,730000,China；2.Thesecondpeople’shospitaloflanzhoucity，730000，china)

Objective：To observe the therapautic effects of Qilongyishen tang on rats with nephropathy(DN).Methods：60 Wistar SPF rats were weighed，10 rats were randomly selected as normal control group and fed them with ordinary diet.While the other rats were fed with high fat diet for 8 weeks then injected with streptozotocin(STZ)in lower dose of 30 mg/kg for three days after fasting for 12 hours.When the diabetic nephropathy model was establishied，rats were weighed and divided randomly into model group，group treated with Irbesantan and groups treated with traditional Chinese medicine in low，medium and high dose.Each group had 9 rats.All rats were placed in metabolic cages and observed the general vital energy，urinary production and 24-hour urine preotein after consecutive 8 weeks intervention.The rats were then anesthetized and blood samples were collected.Finally，the serum was separated and the level of Cys-c and HbAlc was determined.Result：The level of Cys-c，HbAlc，FPG and umAlb in the model group were singnificantly higher than that in the normal group(P<0.05)，which were in the treatment with traditional Chinese medicine in medium and high dose and Irbesantan group were significantly lower than those that were in the model group(P<0.05).Conclusion：Qilongyishen tang can reduce the level of early diabetic nephropathy rats’ serum Cys-c，HbAlc，FPG and umAlb.

Diabetic nephropathy；Qilongyishen tang；Cys-c；HbAlc；umAlb

2015-01-15)

甘肃省中医药管理局基金资助项目(GZK-2012-63)

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许筠，主任医师，硕士生导师，研究方向：中西医结合防治糖尿病肾病; E-mail:38845597@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.4.011