ITS2序列鉴定十大功劳属药用植物△

明孟碟，张超，严绪华，刘美霞，夏叶，杨红兵*，胡志刚*

(湖北中医药大学，湖北 武汉 430065；2.武汉市中医医院，湖北 武汉 430010)

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ITS2序列鉴定十大功劳属药用植物△

明孟碟1，张超1，严绪华2，刘美霞1，夏叶1，杨红兵1*，胡志刚1*

(湖北中医药大学，湖北 武汉 430065；2.武汉市中医医院，湖北 武汉 430010)

目的：基于ITS2序列鉴定十大功劳属药用植物，以避免该属物种药用基原混乱。方法：收集十大功劳属物种作为实验材料，采用改良的CTAB法提取总DNA，经PCR扩增、双向测序和序列拼接，应用MEGA 6.0对该属13个物种43条ITS2序列进行序列变异分析，计算种内种间Kimura 2-parameter(K2P)距离，构建系统邻接(NJ)树。结果：十大功劳属13个物种43条ITS2序列分析结果表明，各物种种内最大(平均)K2P距离均不大于种间最小(平均)K2P距离；系统NJ树结果显示，十大功劳属其中9个物种各自聚为一支。结论：ITS2序列对十大功劳属药用植物具有较好鉴定效果，为该属药用植物的临床用药安全提供了分子依据。

十大功劳属；ITS2序列；药用植物；分子鉴定

小檗科Berberidaceae 十大功劳属Mahonia植物是一类常见的药用、观赏两用的植物[1]，在我国分布有31种[2]，其中药用22种[3]，主要以根、茎入药。《中华人民共和国药典》(2015年版)将该属物种阔叶十大功劳Mahoniabealei(Fort.) Carr.和细叶十大功劳M.fortunei(Lindl.) Fedde.的干燥茎作为“功劳木”药材的来源，功劳木含有生物碱、挥发油及总黄酮等多种有效成分[4-5]，具有清热燥湿、泻火解毒、滋阴益肺、兼补肝肾的功效[6]。由于该属物种形态上极为相似，市场上存在用长柱十大功劳M.duclouxianaGagnep.和小果十大功劳M.bodinieriGagnep.等充当“功劳木”药材使用的情况[7-8]，给用药安全带来隐患。运用传统的鉴定方法区分该属物种存在一定的局限性[9-11]。如何快速、准确地区分十大功劳属药用植物，对该属药用物种的资源开发和临床应用具有重要意义。

随着分子生物技术的快速发展，利用遗传物质DNA鉴定物种逐渐成为国际分子鉴定的研究热点。DNA条形码是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA片段来实现物种鉴定的一种分子生物学技术，是近年来生物分类学的研究热点[12]。该方法具有快速、准确、不受样品的形态性状限制等优点，适用于药材和基原物种的鉴定，是传统中药鉴定方法的有效补充。陈士林等[13-17]在研究了6115个物种30 886个样品的基础上，提出了以ITS2为主体条形码序列鉴定中药材的方法体系，推动中药鉴定学迈入规范化、标准化基因鉴定时代。有关学者利用ITS2序列鉴定葶苈子[18]、羌活[19]、赤芍[20]、金沸草[21]、红景天[22]以及谷物芽类[23]等药材，均取得了较好的鉴定结果。本研究运用ITS2序列对十大功劳属药用植物进行分子鉴定，为十大功劳属药用植物的区分提供分子依据。

1 材料

本研究收集十大功劳属8个物种32份实验材料，经湖北中医药大学生药教研室张秀桥教授鉴定，另从GenBank下载11条序列，经查阅文献证实其基原准确可靠[24-26]。植物材料来源及GenBank下载序列信息详见表1。

表1 十大功劳属实验材料及GenBank下载序列信息

2 方法

2.1 DNA提取

取样品的干燥叶片30 mg，用球磨仪(Retsch MM400)以30 Hz/s研磨2 min，利用改良的CTAB法[27]提取总DNA。

2.2 PCR扩增及测序

ITS2序列：正向引物 ITS2-2F(5′-ATGCGATAC-TTGGTGTGAAT-3′)，反向引物ITS2-3R(5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′)；反应体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，正、反向引物(2.5 μmol·L-1)各1.0 μL，总DNA 2 μL，加灭菌双蒸水至25 μL；扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s(进行40个循环)；72 ℃延伸10 min[28]。

琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物情况，用ABI 3730XL测序仪(Applied Biosystems Co.，USA)对条带单一且清晰的PCR产物进行双向测序。

2.3 数据处理

所得序列使用CondonCode Aligner V 4.2.4(CondonCode Co.，USA)软件进行质量分析和拼接；使用基于隐马尔可夫模型的HMMer 注释方法去除两端5.8S和28S区段，获得ITS2间隔区序列[29]。所有序列用MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)6.0 进行序列比对分析[30]，基于K2P(Kimura2-Parameter)双参数模型计算种内种间遗传距离，采用邻接(Neighbor Joining，NJ)法构建系统聚类树。

3 结果与分析

3.1 十大功劳属药用植物序列变异分析

十大功劳属13个物种43条序列比对后长度为224 bp，共产生28个变异位点；细梗十大功劳与宽苞十大功劳、细叶十大功劳与北江十大功劳之间未出现种间变异，其它物种均存在种间变异位点。

3.2 十大功劳属药用植物遗传距离分析

运用K2P模型对十大功劳属物种ITS2序列进行遗传距离分析，结果见表2。结果表明，细叶十大功劳与北江十大功劳、宽苞十大功劳与细梗十大功劳两组序列无变异位点，故其种内最大K2P距离均等于种间最小K2P距离，其它各物种的种内最大(平均)K2P距离均小于其与其它物种种间最小(平均)K2P距离。

表2 十大功劳属各物种种内及与其它物种种间K2P距离

3.3 十大功劳属药用植物系统NJ 树鉴定

基于ITS2序列，应用邻接(NJ)法构建十大功劳属药用植物的系统聚类树，见图1。从系统NJ树看出，细叶十大功劳与北江十大功劳聚为一支，宽苞十大功劳与细梗十大功劳聚为一支；除此以外，该属其它物种各自聚为一支，各物种间能明显区分开。

注：bootstrap 1000次重复，仅显示支持率≥50%的分支图1 基于ITS2 序列构建的十大功劳属药用植物邻接(NJ)树

4 讨论

根据文献记载[3]，我国十大功劳属植物中具有药用价值的有22种，它们无论在植物形态还是药材形状方面都具有一定的相似性，易造成混用。采用DNA条形码这种快速、有效、准确的鉴定方法对我国十大功劳属药用植物进行鉴定，可有效解决物种基原混乱等问题，为合理开发利用我国十大功劳属植物资源提供理论依据。

基于MEGA 6.0软件的序列变异分析结果显示，细叶十大功劳与北江十大功劳间未产生变异位点，宽苞十大功劳与细梗十大功劳间未产生变异位点，因此基于变异位点无法区分这两组物种；这一结果在两组物种间的K2P距离和NJ 树分析结果中也得到了验证。目前十大功劳属药用植物的鉴定研究不多，运用DNA分子鉴定技术对该属药用植物鉴定，针对无法区分的细叶十大功劳与北江十大功劳、宽苞十大功劳与细梗十大功劳两组物种，可考虑筛选其它序列或复合序列进行分子鉴定。除这两组物种外，该属其它各物种种间均存在变异位点；各物种种内最大(平均)K2P距离均小于其与其它物种种间最小(平均)K2P距离；系统NJ 树结果表明，各物种均各自聚为一支，相互之间能很好地区分开。以上实验结果均表明，ITS2序列可以较好地鉴定十大功劳属药用植物。

十大功劳属药用植物种类繁多，形态相似，给药材的识别和流通带来了困难。为更便捷地实现对该属药用植物的鉴定，可将中药材二维DNA 条形码技术运用于药材的鉴定中来。中药材二维DNA条形码[31]是指基于开源代码QR Code(quick response code) 将DNA条形码技术与二维码技术相结合，以达到快速、稳定、便捷地鉴定中药材的目的。为此，可在本研究的基础上，将各物种的ITS2序列转换为二维码，通过扫描识读，以实现对该属药用植物的快速、准确识别。

综上，该研究所采用的各种分析方法都表明，ITS2序列可用于鉴定十大功劳属药用植物，为该属药用植物的区分和临床用药安全提供了分子依据。

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IdentificationofGenusMahoniaMedicinalPlantsBasedonITS2Sequence

MINGMengdie1，ZHANGChao1，YANXuhua2，LIUMeixia1，XIAYe1，YANGHongbing1*，HUZhigang1*

(1.HubeiUniversityofChineseMedicine，Wuhan430065，China；2.WuhanHospitalofTraditionalChineseMedicine，Wuhan430010，China)

Objective：To Identify the genusMahoniamedicinal plants，based on ITS2 sequences.Methods：Total genomic DNA was extracted from experimental materials by the improved CTAB method.The ITS2 sequences were obtained after PCR amplification，bidirectional sequencing and sequence assembly.The genetic distances based on the Kimura 2-parameter(K2P)model，variable sites and neighbor-joining(NJ)phylogenetic tree were computed by MEGA 6.0.Results：Based on ITS2 sequences，the study indicated that the intraspecific maximum and average genetic distances were no greater than the interspecific ones.In all of the 13 samples，9 of them were respectively clustered into a single branch in the NJ phylogenetic tree.Conclusion：ITS2 sequence has a good effect on the identification of the genusMahoniamedicinal plants，which can provide basis to ensure the safety of medicines of the genusMahoniamedicinal plants.

Mahonia；ITS2 sequence；medicinal plants；molecular identification

2015-08-08)

重大新药创制国家重大科技专项子课题(2014ZX09304307001-021)；湖北省科技支撑计划项目(2015BCA275)

*

杨红兵，教授，研究方向：中药品种、质量与资源研究；Tel：027-68890106，E-mail：yanghb321@126.com；胡志刚，副教授，研究方向：中药资源与分子鉴定；Tel：027-68890106，E-mail：zghu0608@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.001