鸦胆子药材及其混伪品的 ITS2 序列分子鉴定研究△

马双姣，杨培，周红，孙伟，姚辉*，李永华

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700；3.广西中医药大学 药学院，广西 南宁 530001)

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鸦胆子药材及其混伪品的 ITS2 序列分子鉴定研究△

马双姣1，杨培1，周红1，孙伟2，姚辉1*，李永华3*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700；3.广西中医药大学 药学院，广西 南宁 530001)

目的：通过分析鸦胆子及其混伪品的ITS2序列，探究鉴定鸦胆子药材及其混伪品的新方法。方法：采用改良的CTAB法提取鸦胆子及其混伪品的基因组DNA，PCR扩增ITS2片段。对其进行双向测序，应用MEGA 6.0软件进行序列分析，计算种内、种间遗传距离，构建邻接树。结果：鸦胆子药材ITS2序列长度为230 bp，种内最大K2P遗传距离为0.018，小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离0.493。NJ树结果表明鸦胆子序列和柔毛鸦胆子序列聚为一支，与其他混伪品可明显区分。鸦胆子与柔毛鸦胆子在35位点处有一变异位点，利用此位点能将鸦胆子与柔毛鸦胆子区别开来。结论：ITS2可作为鸦胆子药材及其混伪品鉴定的DNA条形码序列，为保障临床用药安全提供了新的技术手段。

鸦胆子；ITS2；鉴定；DNA条形码；混伪品

中药材鸦胆子(Bruceae Fructus)为苦木科植物鸦胆子Bruceajavanica(L.)Merr.的干燥成熟果实，产于我国南方地区。鸦胆子性味苦，寒，有小毒，具有清热解毒，截疟，止痢的功效。可用于痢疾，疟疾，外治赘疣，鸡眼[1]。鸦胆子含生物碱、糖苷、酚性成分和鸦胆子酸，具有诱导癌细胞凋亡及影响相关基因表达、提高机体免疫功能、抗疟、抗肿瘤、抗阿米巴、驱肠虫等多种生物活性，研究表明鸦胆子油静脉乳油滴和癌细胞亲和力较大，有直接杀伤作用，并能保护正常骨髓，提高白细胞的数量，其作用完全符合其腐蚀赘扰的功效，具有重要的药用价值[2-6]。然而工作中常有伪品苦木科柔毛鸦胆子BruceamollisWall.、交让木科植物牛耳枫DaphniphyllumcalycinumBenth.、木犀科植物女贞LigustrumlucidumAit.、黄杨科植物小叶黄杨BuxusmicrophyllaSieb.et Zucc.、楝科植物灰毛浆果楝Cipadessacinerascens(Pell.)H.-M.的干燥果实以及豆科植物苦参SophoraflavescensAit.的种子相混之[7-10]。由于它们功效相差甚远，混用乱用不仅耽误病情，还严重影响了临床用药安全，因此对其进行准确鉴定显得尤为重要。

近年来，已有多位学者对鸦胆子及其混伪品从药材性状、显微特征等方面进行鉴别[7-10]。而从DNA条形码的角度对鸦胆子及其混伪品的鉴定研究甚少，仅李美妮等[11]在对女贞子及其混伪品的研究中将鸦胆子作为女贞子的混伪品之一进行了ITS2序列分析。

DNA条形码是Hebert等[12]于2003年首次提出的，是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充，成为近年来生物分类和物种鉴定的研究热点[13-16]。Chen等[17]通过对6000余份药用植物样本进行DNA条形码序列筛选，发现ITS2序列的物种水平鉴定能力达92.7%，并首次提出以ITS2为核心，psbA-trnH为补充序列的药用植物DNA条形码鉴定体系。随后Yao等[18]提出了ITS2序列可作为植物物种鉴定通用条形码。ITS2序列作为DNA条形码的准确性和稳定性在红景天[19]、重楼属[20]、川芎[21]、蛇床[22]、羌活[23]、北豆根[24]、金银花[25]等中药材鉴定中得到验证。目前，中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则已纳入《中华人民共和国药典》2010版第三增补本[1]。

为确保鸦胆子药材的正确用药和安全用药，本研究应用DNA条形码序列ITS2对鸦胆子药材及其易混品进行鉴定研究，为鸦胆子的准确鉴定提供依据。

1 植物材料

本研究涉及鸦胆子及其混伪品共9个物种41个研究对象，包含实验样本33份，GenBank下载序列8条。其中鸦胆子样本22份(包括基原植物样本、药材样本、复核样本和对照药材样本)，相关信息详见表1。样品均经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员鉴定。复核样本由中国中医科学院中药研究所进行复核，对照药材(编号FDC321)来自中国食品药品检定研究院。

表1 材料来源

2 方法

2.1 DNA提取、PCR扩增和测序

将鸦胆子及其混伪品用75%酒精棉擦拭干净后，切碎，果实样品取果皮约30 mg，叶片样品取变色硅胶干燥叶片约20 mg，用研磨仪(Retsch MM400，Germany)研磨2 min(30次/秒)后用植物DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取总DNA，56 ℃水浴过夜(叶片样本65 ℃水浴1 h)，其余步骤按照试剂盒说明书进行。ITS2通用引物S2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′和S3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。反应条件为94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40 循环；72 ℃ 10 min。PCR反应体系为2×Taq Mix Master 12.5 μL、正反向引物(2.5 μM)各1.0 μL、总DNA 2 μL(～30 ng)，其余用ddH2O补至25 μL。电泳查看PCR扩增情况，进行双向测序。

2.2 数据处理

将所有的序列用软件MEGA 6.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)分析[26]，并基于K2P模型进行遗传距离等分析，用邻接(NJ)法构建系统聚类树，利用Bootstrap(1000 次重复)检验各分支的支持率。

3 结果与分析

3.1 鸦胆子及其混伪品ITS2序列特征

本研究比较了22条鸦胆子ITS2序列，所得序列比对后长度为230 bp，变异位点为4个，简约信息位点3个(简约信息位点是指在两个及以上分类单元的序列中存在差异，且其中至少有两种变异类型在该位点出现两次及以上)，有4个单倍型，各单倍型变异位点及序列条数见表2。鸦胆子与各混伪品种间序列进行比对后长度为266 bp，鸦胆子平均GC含量64.2%，混伪品中GC含量最高的是小叶黄杨，为71.7%，GC含量最低的是女贞，为53.8%。应用MEGA 6.0进行分析，以Kimura 2-parameter(K2P)计算遗传距离。鸦胆子的种内K2P距离为0～0.018，平均K2P距离为0.005。与其混伪品柔毛鸦胆子、牛耳枫、女贞、小叶黄杨、苦参以及灰毛浆果楝平均K2P距离分别为0.014、0.769、0.594、0.657、0.646以及0.280，除柔毛鸦胆子外，鸦胆子与其它混伪品的种间最小K2P距离大于种内最大K2P距离(见表3)。ITS2序列间存在的变异位点多达192个。通过分析发现，鸦胆子22份样品的ITS2序列在35位点处均为C，柔毛鸦胆子为T，可通过此位点对鸦胆子和柔毛鸦胆子进行区分，但尚需收集柔毛鸦胆子样品对此变异位点的稳定性进行进一步验证。

3.2 鸦胆子及其混伪品的聚类分析

通过基于ITS2序列(单倍型)构建的鸦胆子及其混伪品的NJ系统聚类树可以看出(如图1)，鸦胆子序列与柔毛鸦胆子序列聚为一支，混伪品牛耳枫、女贞、小叶黄杨、苦参以及灰毛浆果楝各自聚为一支，能够与鸦胆子明显区分开。因此，ITS2序列作为条形码可准确鉴别鸦胆子药材及其混伪品牛耳枫、女贞、小叶黄杨、苦参以及灰毛浆果楝。

表2 鸦胆子ITS2序列变异位点

注：*表示与第一行碱基相同。

表3 种内种间K2P距离计算结果

图1 基于ITS2序列构建的鸦胆子与其混伪品的NJ树(拉丁名后为单倍型编号Bootstrap 1000次重复，支上数值仅显示自展支持率≥50%)

4 讨论

我国中药资源种类繁多，蕴藏量大，但人均分布少，且近年来随着人们生活水平和保健意识的提高，中药的需求量也越来越大，致使市场上以假乱真的现象频繁出现，中药基原鉴定的准确性对资源的可持续利用以及中药的临床疗效至关重要。传统的中药材鉴定方法，如性状、显微、和化学定性分析法、色谱法等，在中药材鉴定和质量评价中虽然发挥了重要作用，但是这些传统的鉴定方法各有优劣：药材形态鉴定难以区分性状相似的近缘种，而且植物形态易受地理环境、生长期、贮存条件诸多因素的影响，从而影响鉴定的准确性；化学分析方法会因中药活性成分的含量受到其生理条件、采收时间、贮藏等因素的影响，同时对化学成分相似的物种也较难以区分。生药鉴定学的发展面临巨大的挑战，传统生药鉴定方法难以满足现代物种鉴定的需求[27]。DNA条形码鉴定技术只需选用一个或少数几个基因片段即可对某个属、科甚至几十个科的绝大部分物种进行准确鉴定，且鉴定过程更加快速，重复性和稳定性高，不受药材性状的影响，直接从基因水平提供鉴定依据，即使是没有任何鉴别经验的人员通过DNA条形码标准化流程都能够准确区分药材的正品及混伪品。DNA条形码的研究将日臻完善，为植物的分类鉴定及新物种的发现提供快捷、准确的信息，成为植物分类学家有益的辅助工具，并能有效鉴定中药材基原植物。

本文测定了鸦胆子及其混伪品的ITS2条形码序列，结果表明除柔毛鸦胆子外，鸦胆子与其混伪品的ITS2序列比对后发现变异位点较多，鸦胆子种内最大遗传距离(0.018)小于其与除柔毛鸦胆子以外的混伪品种间最小遗传距离(0.269)。基于ITS2序列建立的NJ树可以很明显地把不同来源的鸦胆子与其混伪品牛耳枫、女贞、小叶黄杨、苦参以及灰毛浆果楝鉴别开来；鸦胆子与柔毛鸦胆子在35位点处有一变异位点，但由于柔毛鸦胆子样本量偏少，还需要收集柔毛鸦胆子样品对此位点进行进一步验证。本研究中鸦胆子与其混伪品女贞子ITS2序列的K2P距离及NJ树聚类结果均与李美妮等基于ITS2序列的女贞子原植物及其混伪品的分子鉴定[11]的研究结果一致，说明采用DNA条形码技术鉴定药材具有很好的重复性和稳定性。由此可见，采用DNA条形码技术能够更加快速、准确的完成中药材鉴定工作，在今后的药材流通和市场管理等实际应用中具有极大的价值。

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MolecularIdentificationofBruceajavanicaandItsAdulterantsBasedonITS2Sequence

MAShuangjiao1，YANGPei1，ZHOUHong1，SUNWei2，YAOHui1*，LIYonghua3*

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China；2.InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalScience，Beijing100700，China；3.CollegeofPharmacy，GuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanning530001，China)

Objective：To explore a new method to identifyBruceajavanica(L.)Merr.from its adulterants by the ITS2 regions.Methods：Genomic DNA ofB.javanicaand its adulterants were extracted by modified CTAB method and then the ITS2 sequences were obtained by PCR amplification and sequenced bidirectionally.All of the 41 ITS2 sequences were aligned through Clustal-W and the genetic distances were computed using MEGA 6.0 in accordance with the Kimura 2-parameter(K2P)model.Results：The sequence lengths of ITS2 regions ofB.javanicawere 230bp.The intra-specific genetic distances were smaller than the average inter-specific ones in ITS2 regions ofB.javanicaand its adulterants.The NJ tree showed thatB.javanicaand its adulterants could be easily differentiated according to their monophyly exceptB.mollis.The ITS2 sequences ofB.javanicaandB.mollishad a variation point at thirty-fifth site，soB.javanicaandB.molliswere able to be identified by this site.Conclusion：ITS2 can be used to identifyB.javanicaand its adulterants，which provide a new technique to ensure its clinical safety.

Bruceajavanica；ITS2；Identify；DNA barcoding；Adulterants

2015-04-08)

国家科技支撑计划(2011BAI07B08)；广西自然科学基金项目(2013GXNSFAA019120)

*

姚辉，副研究员，研究方向：中药资源，Tel：(010)57833194，E-mail：scauyaoh@sina.com； 李永华，教授，研究方向：中药资源，E-mail：liyonghua185@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.003