甘草显微定量的方法研究△

杨智峰，高玉娟，李敬梅

(1.陕西省中医药研究院，陕西 西安 710003；2.西安医学院 第一附属医院，陕西 西安 710077)

·基础研究·

甘草显微定量的方法研究△

杨智峰1*，高玉娟1，李敬梅2

(1.陕西省中医药研究院，陕西 西安 710003；2.西安医学院 第一附属医院，陕西 西安 710077)

目的：完善甘草显微定量的方法。方法：在已有显微定量方法的基础上，以混悬制样代替“水飞”制样，以血球计数板代替普通载玻片；利用线性分析方法确定取样量，用正交试验方法，优化制片用混悬液配比和定量需要观察制片的数量，进行混悬液稳定性考察，确定实验用时。结果：样品细度要求100目，样品定量需制片10张，记录显微特征个数并计算。结论：引用血球计数板，提高显微定量的易操作性和准确性，方法是可行的。

甘草；显微特征常数；显微定量；统计分析；正交试验

药材显微定量的方法研究，康廷国、苑冬梅教授研究的较多，随后在中成药组分定量、中药炮制方面有应用，用混悬剂以“水飞”方法制样，利用传统载玻片、盖玻片、微量进样器、网格式测微尺和显微镜进行，每个样品制片5～10张[1-6]。理论根据在于，单位药材样品显微特征个数是常数。其缺点在于：“水飞”方法制样误差较大，显微进样器的孔径难以满足要求，定量溶液制片不易操作，全盖玻片观察计数困难很大，误差不易控制，局部计数体积难以确定，因此该法需要完善。

笔者对甘草显微定量方法进行了改进。用混悬剂以定量混悬的方法制样，利用血球计数板、盖玻片、定量滴管和显微镜进行，理论根据和样品制片数同上，希望能提高显微定量法的精度，便于应用。

1 实验用品、仪器与材料

1.1 实验用品及仪器

血球计数板，盖玻片，样品盒，10 mL容量瓶，定量滴管。千分之一电子天平，Olmypus显微镜(使用镜头15 mm×10 mm)，烘箱，冲筒，100目套筛。

1.2 材料

化学纯甘油、水合氯醛和蒸馏水。

共收集15份甘草样品，其中1～5号采自陕西神木县(批号：20120825、20120826、20130821、20130823、20140920)，6～15号为市售甘草(西安万寿路药材市场，产地：甘肃，批号：20111128、20120816、20130412、20130618、20140311、20111026、20120815、20130810、20140615、20140721)，所有样品经本文第一作者鉴定，1～10号为甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根，11～15号为胀果甘草GlycyrrhizainflataBat的干燥根。

2 方法

2.1 样品粉碎

由于血球计数板空间高度为0.1 mm，即100 μm，计算甘草样品粉碎应为100目。预试验证明，100目甘草样品，易于制成混悬液，初步稳定性考察可在30 min以上。取甘草样品，闷润，切片，65 ℃烘干，冲筒粉碎，不留残渣，过100目筛，细粉备用。

2.2 制样

取甘草样品粉末适量(多在100 mg以下)，加水合氯醛液适量，再加一定浓度的稀甘油适量，振摇混悬，定容于10 mL容量瓶中，振摇混匀，备用。

2.3 血球计数板样品池充液量

经测量和计算，一个样品池需混悬液约0.02 mL。

2.4 滴管液滴大小考察

取滴管，吸取1 mL混悬液，10次，记录1 mL混悬液滴出液滴的数量，并记录，经计算1滴约0.046 mL能满足样品池充液要求。

2.5 制片

用验证过的滴管(1 mL溶液，滴20滴左右)，滴一滴，进入盖有盖玻片的血球计数板样品池中，两个样品池各一滴，即成。

2.6 显微观察

每个样品制片10张，观察、记录20个数据，因每个计数板有两个样品池，要求2 h内完成，此由显微特征在混悬液中的稳定性决定。

2.7 样品计数显微特征的确定

计数显微特征在实验时间内稳定，形态上没有变化，如部分溶解，同时要易于观察。

2.8 显微特征个数和药材显微特征常数的计算

由于血球计数板一个样品池中大方格体积为0.4 mm3，计数仅计大方格中显微特征个数，若以n张片子中显微特征个数(X)为基数，则10 mL样品液中显微特征个数(Y)的计算公式：Y=12 500X/n。10 mL样品混悬液中药材质量(M，mg)，该药材显微特征常数(K)为：K=Y/M(个·mg-1)。

3 实验

3.1 混悬液稳定性试验

取甘草样品适量(陕西神木，批号：20120826，51.5 mg)，加混悬液(由60%稀甘油和水合氯醛试液组成，比例19∶1)，定容于10 mL容量瓶中，摇匀，每隔20 min制片1次，每次10张，比较前后计数情况，RSD=0.95%，确定溶液稳定的时间为2 h。

3.2 线性范围考察

取甘草样品(陕西神木，批号：20120826)0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、010 g，用60%稀甘油和水合氯醛试液，定容于10 mL容量中，配比19∶1，各样品制片10张，记录显微特征个数，进行单位质量与显微特征个数关系的回归分析，计算相关系数，与相关系数临界值相比，高度相关，回归方程：Y=423.433 1X+122 153，r=0.996 7，线性范围在40～100 mg。

3.3 制片影响因素的考察

从预试验情况看，影响显微特征计数的因素有稀甘油浓度、稀甘油与水合氯醛试液配比和观察片子的数量。故进行四因素三水平正交试验，样品细度100目，取样量50～60 mg，因素水平安排见表1，试验设计及极差分析见表2，方差分析见表3。

表1 制片正交试验因素水平表

观察方法：取样，称量，用规定溶液或试剂，按一定比例，混悬样品，定容于10 mL容量瓶中；取血球计数板，盖上盖玻片，用滴管给每个样品池滴液一滴，注满，一次制够所需片数，置显微镜下观察，记录每个样品池大方格中显微特征个数，按上法计算显微特征常数(个·mg-1)。

从方差分析情况可知，实验用甘油溶液浓度对显微特征常数确定影响非常显著，观察片数对其影响显著，综合极差和用时情况，最终确定显微定量方法：取样，称量，用60%甘油溶液和水合氯醛试液(19∶1)混悬，用血球计数板制片10张；观察，计算即可。

表2 制片正交试验设计及结果

表3 方差分析表

注：F0.05(2，2)=19，F0.10(2，2)=9。

3.4 重复性考察

称取甘草样品(陕西神木，批号：20120826)6份，每份约50 mg，用60%甘油液和水合氯醛试液，19∶1混悬，定容于10 mL容量瓶中，每份制片10张，记录并计算显微特征常数，均数1 490.5个·mg-1，RSD=1.47%，重复性好。

3.5 样品显微特征常数均数的确定和不同产地样品均数之间的比较

取神木甘草、甘肃甘草和陇西甘草，约50 mg，各3份，以确定方法制片10张，置显微镜下观察，记录显微特征个数，计算样品显微特征常数均值，分析不同产地样品均数之间的关系，数据见表4。用SPSS17软件进行成对资料统计分析，神木样品与甘肃样品的显微特征常数均值之间差异有统计学意义，置信系数为0.01；神木样品与陇西样品的显微特征常数均值之间差异有统计学意义，置信系数为0.01。

表4 不同产地样品显微特征常数

4 结果

血球计数板用于甘草显微定量是可行的，具体方法：取过100目筛样品适量，加入水合氯醛试液1份，然后加入60%甘油19份，混悬定容于10 mL容量瓶中，用确定过液滴大小的滴管，吸取一滴，滴于已盖有盖玻片的血球计数板上，充满样品池，制片10张，置显微镜下观察，记录四个大方格内的显微特征个数，计算即可。从重复性实验数据的RSD看实验可重复性强。血球计数板样品池高度一定，样品池计数面积一定，故可提高样品的观察精度。

5 讨论

不同产地样品显微特征常数的均值差异，是植物种间差异和产地差异共同作用的结果，物种差异影响较大，产地差异影响较小，可以肯定的是，神木产甘草与甘肃产甘草不同。

从本研究看，显微特征常数是一个区间，这个区间受物种、生长年限和产地影响，但在一定范围之内，具体情况将在后续研究报告中予以详述。

[1] 陈聪慧，康廷国.金银花显微特征常数与化学成分相关性研究[J].中药材，2011，34(9)：1373-1376.

[2] 张洪春，君海波，王婷，等.老鹳草类药材的显微定量研究[J].辽宁中医药大学学报，2008，10(5)：155-156.

[3] 苑冬梅，刘扬，栾晓静，等.黄柏的显微定量研究[J].中华中医药学刊，2007，25(5)：964-966.

[4] 苑冬梅，栾晓静，鞠庆波，等.中药显微定量法的应用研究[J].辽宁中医杂志，2006，33(4)：459-460.

[5] 刘歆韵，康廷国.逍遥丸中白芍、茯苓的显微定量研究[D].大连：辽宁中医药大学，2010.

[6] 吴楠，康廷国.杞菊地黄丸中菊花、八珍益母丸中益母草显微定量研究[D].大连：辽宁中医药大学，2011.

AStudyofMicro-quantitativeMethodsforLicorice

YANGZhifeng1，GAOYujuan1，LIJingmei2

(1.ShaanxiAcademyoftraditionalChinesemedicine，Xi’an，710003，China； 2.FirstAttachedHospitaltoXi’anMedicalCollege，Xi’an710077，China)

Objective：To improve the micro-quantitative methods for licorice.Methods：Based on existing micro-quantitative methods，“ShuiFei” example preparation pattern (the process by which solid powder and liquid are grinded together in order to make suspension or remove contaminants) replaced by suspending example preparation pattern，and substitute blood counting plates for microscope slides.Sampling number was determined by linear analysis.The proportion of suspension for plates making as well as the number of sampling plates needed to be observed to confirm the quantity were optimized by orthogonal experiment method，then the inspects on suspension stability was casted and experiments time was confirmed.Results：It turned out that sampling fineness should be 100 mesh，and determination of sample quantity needed 10 slides.After the preparation，the number of micro-characteristics of samples was counted and calculated.Conclusion：It is a practical way by using blood counting plates to increase the handle ability and accuracy of micro-quantitative method.

Licoricer；micro-characteristic constant；micro-quantitation；statistic analysis；orthogonal experiment

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.11.013

2014-12-03)

陕西省科技攻关项目(2012K19-03-08)

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杨智峰，研究员，研究方向：生药学和中药鉴定；E-mail：yzfeng_001@163.com