长春花生物碱类化合物液相色谱/四级杆-飞行时间质谱分析△

于海川，赵杰，吴娇*，侯贝贝，臧楠，仝温温

(1.新乡医学院 医学检验学院，河南 新乡 453003；2.河南省分子诊断与医学检验技术协同创新中心，河南 新乡 453003；3.新乡医学院 药学院，河南 新乡 453003)

·基础研究·

长春花生物碱类化合物液相色谱/四级杆-飞行时间质谱分析△

于海川1,2，赵杰3，吴娇3*，侯贝贝3，臧楠1，仝温温1

(1.新乡医学院 医学检验学院，河南 新乡 453003；2.河南省分子诊断与医学检验技术协同创新中心，河南 新乡 453003；3.新乡医学院 药学院，河南 新乡 453003)

目的：建立一种长春花生物碱类化合物的液相色谱/四级杆-飞行时间质谱分析方法。方法：本研究采用大孔吸附树脂柱法富集长春花叶中的生物碱类化合物，经Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱(100 mm× 3 mm，1.8 μm)，乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，对长春花生物碱类化合物进行分离。结果：采用正离子电喷雾-飞行时间质谱法测定精确分子量，并结合标准品对照快速鉴定出15个生物碱类化合物。结论：该方法结合了液相色谱的高分离效能与高分辨质谱的准确性及选择性，具有快速、稳定可靠的特点，可为长春花细胞培养工艺优化和质量控制提供参考。

长春花；生物碱；液相色谱/飞行时间质谱

长春花Catharanthusroseus(L.)G.Don为夹竹桃科(Apocynaceae)长春花属Catharanthus植物长春花的全草，又称雁来红、日日新、四时春和三万花等，是一种分布广泛的药用、观赏植物[1]。长春花次生代谢产物相对丰富，从其中已分离鉴定出130多种萜类吲哚生物碱[2-4]，其中长春碱、长春新碱、长春质碱和文多灵是4种具有非常重要药用价值的吲哚类生物碱。长春质碱、文多灵是合成长春碱的前体，长春碱和长春新碱已成为应用最为广泛的两种天然植物抗肿瘤药物[5]；阿玛碱和蛇根碱作为高效降压药于临床上使用；文多灵、环氧长春碱和长春质碱被广泛用于治疗糖尿病等[6]。

长春花植物体中的长春碱和长春新碱仅有百万分之几或十万分之几，远远不能满足临床上对长春碱或长春新碱的特殊抗癌疗效的需求。目前人们主要还是需要花费巨额成本从长春花植物体提取长春花生物碱类化合物。近三十年来，科学家希望通过长春花细胞培养，提高细胞中的长春碱或长春新碱含量，在不同植物器官的培养、培养条件优化[7]、添加代谢前体和诱导子[8]等方面做了大量工作。因此，针对长春花体内的多种具有重要药用价值的萜类吲哚生物碱，建立一种快速、灵敏、高效、精准的检测技术对长春花细胞培养条件优化和质量评价具有重要意义。

关于长春花次生代谢产物分析测定方法的已有报道，如薄层扫描法[9]、高效液相色谱法[10]及放射性免疫测定法[11]等。但采用联用技术同时对多种长春花生物碱类化合物进行高、精、准的快速检测尚未见报道。液质联用技术是将液相的高分离效能与质谱的强大结构测定功能组合起来，为天然产物活性成分的快速分析提供了一个重要的新技术。四级杆/飞行时间质谱(Q-TOF MS)能提供精确质量数，通过精确的分子质量数的匹配能发现和鉴定化合物，特别是非特定的目标化合物[12]。

本试验采用大孔吸附树脂分离技术获得长春花总生物碱，并运用液相色谱/飞行时间质谱(LC/TOF MS)联用技术对该提取物进行化学成分分析，为长春花总生物碱的制备工艺和质量控制提供重要依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1200 SL型高分离度快速液相色谱/Agilent 6530型四级杆-飞行时间质谱仪；Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱(100 mm×3 mm，1.8 μm)；台式高速冷冻离心机(德国Hettich公司)。

1.2 材料

长春花样品采集于云南省昆明市，凭证标本编号为CR130216，存放于新乡医学院药学院。

2方法与结果

2.1 长春花总生物碱的制备

2.1.1 树脂的预处理 称量AB-8大孔树脂2 Kg，加乙醇(浓度>95%)浸泡24 h，用2 BV乙醇，以1.5 BV·h-1的流速正向通过树脂层，并保持液面高度，最后保留一定量的乙醇，浸泡12 h。然后用2～4 BV水，以1.5 BV·h-1的流速正向通过树脂层，洗至流出液加水不呈白色混浊为止。再用2 BV浓度为1 mol·L-1的盐酸(HCl)溶液，以2 BV·h-1的流速正向通过树脂层，并浸泡2～4 h，用纯水以同样流速洗至流出液pH中性。加入2～3 BV浓度为1 mol·L-1的氢氧化钠(NaOH)溶液，以2.0 BV·h-1的流速正向通过树脂层，用纯水以同样流速洗至流出液pH中性。取适量装入玻璃色谱柱(40 cm×2.4 cm)。

2.1.2 洗脱条件 样品上柱后依次用水、30%、50%、70%、90%乙醇水溶液适量，进行洗脱，流量为8 mL·min-1。

2.1.3 树脂再生 用80%乙醇水溶液2000 mL洗脱柱体至大孔吸附树脂填料颜色为白色，再用4000 mL水洗至无乙醇味，分离柱即可重复使用。

2.1.4 长春花中总生物碱的提取 将采集的样品经50 ℃烘干，粉碎，过60目筛，备用。取等量长春花样品，用80%的甲醇浸泡，超声提取3次，每次30 min，合并滤液，减压浓缩，加适量水稀释后过滤，进行AB-8大孔树脂吸附，然后用30%、50%、70%、90%乙醇水梯度洗脱。将70%乙醇水洗脱液减压蒸干，称重，用色谱纯甲醇溶解定容，离心，取上清，微量移液枪取10 μL，定容至1 mL，用0.45 μm微孔滤膜过滤后备用。

2.2 长春花总生物碱液质联用分析

2.2.1 供试品制备 称取2.1.4所制得的长春花总生物碱20.0 mg，加入20 mL甲醇，振荡20 min，于6000 r·min-1、低温条件下离心10 min，取上清液，得到约20 mL甲醇溶液。将20 mL甲醇溶液旋转蒸发浓缩后，用色谱甲醇定容至5 mL，过0.22 μm滤膜，待分析。

2.2.2 分析条件 色谱条件：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱(100 mm×3 mm，1.8 μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，洗脱程序为0 min 5% A，17 min 90% A，20 min 90% A，25 min 5% A；流速为0.3 mL·min-1；柱温为40 ℃；进样量，5 μL；单个样品运行时间为25 min。

质谱条件：ESI(+)，干燥气为氮气(N2)；温度为350 ℃；流速为10 L·min-1；雾化气压力为241.325 KPa；鞘气温度为400 ℃，流速为12 L·min-1；毛细管电压为3500 V；喷嘴电压为0 V；碎裂电压为75 V；离子扫描范围m/z100～1000；正模式参比离子为121.0855、922.0922。

2.2.3 样品分析 将供试品溶液放入自动进样器中，按选定的测试条件进行检测，得供试品的总离子流色谱图，见图1。

2.2.4 总离子流色谱图中化合物的鉴定 根据飞行时间质谱所测定的[M+H]+值及质谱图谱，通过将LC-TOF-MS检测到的化合物的精确分子量试验值与理论值进行匹配，计算其误差，对误差<10 ppm的化合物在ChemSpider database、PubChem Compound Database和Dictionary of Natural Products等软件中进行匹配和检索，鉴定出15个化合物，结果见表1。

图1 长春花生物碱类化合物的总离子流色普图

表1 长春花生物碱类化合物的LC/ESI-TOF MS分析结果

3 讨论

本文首次运用LC/Q-TOF MS联用技术对长春花生物碱类化合物进行分析研究，根据质谱和精确分子量，通过参考长春花化学成分研究的文献[3]、检索天然产物数据库等方法，鉴定出乙醇提取物中的15个生物碱类化合物。

ESI源雾化室喷嘴电压的大小会影响进入毛细管之前的液滴的带电情况，当毛细管电压为3500 V时，设置喷嘴电压为0 V，使两者之间的压力差为最大值，有利于所有液滴带电，这样进入毛细管的离子数量达到最多，从而实现无歧视检测所有小分子代谢物的信息；当设置喷嘴电压为800 V时，几乎检测不到样品中的离子信息。根据安捷伦喷射离子流聚焦技术，在雾化气周围添加同轴鞘气，并通过提高电喷雾带电液滴的空间聚焦来提高MS的灵敏度，进而提高离子化效率和去溶剂化效率。将进入毛细管之前的离子束进行压缩，达到减少离子扩散、引入更多离子到毛细管中、减少中性溶剂束进入质谱、降低噪音、提高灵敏度的目的。鞘气温度与鞘气流速有关，合适的温度为400 ℃，流速为12 L·min-1。

LC-TOF/MS采用高纯氮气作为干燥气，用于对雾化后的液滴进行干燥，其温度的高低和流速大小对分析结果有一定的影响。此外，干燥气温度与溶剂的蒸汽压有关，蒸汽压越低的溶剂所需干燥气的温度就越高，推荐干燥气流速宜设为6～12 L·min-1，温度宜设为300～350 ℃。本研究根据长春碱、长春新碱和文多灵对照样品的出峰情况，在适宜范围内调节后，根据参考文献设置干燥气温度为350 ℃，干燥气流速为9 L·min-1。

通过采用液质联用技术快速检出长春花生物碱类化合物，对长春花细胞培养工艺进行合理地指导和优化，为其质量控制提供参考。

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LC/Q-TOF MS Analysis of Alkaloids fromCatharanthusroseus

YU Haichuan1,2，ZHAO Jie3，WU Jiao3*，HOU Beibei3，ZANG Nan1，TONG Wenwen1

(1.School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China;2.Henan Collaborative Innovation Center of Molecular Diagnosis and Laboratory Medicine, Xinxiang 453003, China;3.School of Pharmacy, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China)

Objective：The study is aimed to identify the alkaloids ofCatharanthusroseuby LC/Q-TOF MS.Methods：An Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(100 mm× 3 mm，1.8 μm)column was used for the separation of the related substances with a mixture of acetonitrile and 0.1% formic acid buffer solution as the mobile phase by gradient elution.Results：The alkaloids were speculated by electrospray positive ionization LC-TOF/MS accurate ion mass，and verified further through standard substances determination.Alkaloids were separated under the established HPLC condition.Fifteen related alkaloids were characterized.Conclusion：The LC-MS method is useful for the identification of the alkaloids ofC.roseuand the results obtained are valuable for its manufacturing process and quality control.

Catharanthusroseus；alkaloids；LC/Q-TOF MS

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.8.009

2015-01-22)

国家自然科学基金项目(31301135)；河南省教育厅重点课题(13B350215/14B320015)；新乡医学院高层次人才科研启动项目(100403/505002)；新乡医学院科研培育基金(2014QN150)；国家级大学生创新训练项目(201310472054/201310472055)

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吴娇，副教授，博士，研究方向：中药和天然药物的生物活性及其作用机理研究；Tel：(0373)3831981，E-mail：wujiao@xxmu.edu.cn