星点设计-响应面法优化黄柏提取工艺研究△

武婧，宋忠兴，古川，刘红波，翟思程，唐志书*

(1.陕西中医药大学/陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712046；3.陕西省风湿与肿瘤类中药制剂工程技术研究中心，陕西 咸阳 712046；4.陕西兴盛德药业有限责任公司，陕西 铜川 727031)

·中药工业·

星点设计-响应面法优化黄柏提取工艺研究△

武婧1,2,3，宋忠兴1,4，古川1,2,3，刘红波1,2,3，翟思程1,2,3，唐志书1,2,3*

(1.陕西中医药大学/陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712046；3.陕西省风湿与肿瘤类中药制剂工程技术研究中心，陕西 咸阳 712046；4.陕西兴盛德药业有限责任公司，陕西 铜川 727031)

目的：利用星点设计-响应面法优化黄柏的最佳提取工艺。方法：以盐酸小檗碱含量为评价指标，选取提取时间、液料比、提取次数3个因素进行Box-Behnken中心组合设计，通过星点设计-响应面法确定黄柏最佳提取工艺。结果：黄柏的最佳提取工艺为水煎煮提取，液料比8∶1，提取时间90 min，提取3次，盐酸小檗碱得率为32.15 mg·g-1。结论：采用星点设计-响应面法优化黄柏提取工艺，方法简单合理，且具有良好的预测性。

星点设计-响应面法；黄柏；工艺优化

黄柏[1]又名关黄柏、川黄柏，为芸香科植物黄皮树PhellodendronchinenseSchneid.的干燥树皮。现代药理学研究表明，黄柏具有抗病原微生物、抗溃疡、降压、抗心律失常等作用[2]，具有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮等功能。黄柏主要有效部位为生物碱类化合物，其中盐酸小檗碱为其主要有效成分[3]，含量高达3%以上[4]。

响应面法(Response Surface Methodology，RSM)是利用合理的试验设计方法，通过试验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。目前中药的提取工艺设计多采用正交设计法，其不能利用较少的试验数据找到因素与响应值间明确的函数关系[5]，以得到最佳的工艺因素组合。响应面优化法所获得的信息量大，直观、预测性好。本研究采用响应面法，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，通过试验数据建立多元回归方程的拟合函数模型，优化黄柏提取工艺，以期为实际的生产提取工艺提供科学参考数据。

1 仪器与材料

日立LC-7000A单泵系统液相色谱仪；旋转蒸发仪RE-3000(上海亚荣生化仪器厂)；分析天平AL-2049[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；101型电热鼓风干燥箱(北京科伟永鑫实验仪器设备厂)；KH-400KDE型高功率数控超声波清洗机(昆山禾创超声仪器有限公司)。

黄柏药材购于西安盛兴中药饮片厂，经陕西中医药大学生药教研室王继涛教授鉴定为黄柏的树皮；盐酸小檗碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110713-200107)；乙腈、甲醇为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；磷酸、十二烷基磺酸钠均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 黄柏中盐酸小檗碱分析方法的建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil ODS C18(150 mm×4.0 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(50∶50，每100 mL加十二烷基磺酸钠0.1 g)[6]；检测波长：265 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱对照品5.03 mg，置于50 mL容量瓶中，加流动相制成质量浓度为0.1 mg·mL-1的溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 称取黄柏药材各50 g，精密称定，精密吸取不同方法提取的黄柏提取液1 mL，置10 mL容量瓶中，加流动相定容至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

2.1.4 标准曲线的绘制 分别精密量取盐酸小檗碱对照品溶液4、6、8、10、12、15 μL，注入高效液相色谱仪中，按2.1.1项下条件测定峰面积。以盐酸小檗碱进样量(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：Y=16.964X-0.47，r=0.999 4，表明盐酸小檗碱在0.4～1.5 μg与峰面积积分值线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 同一对照品溶液重复进样6次，测定峰面积，计算RSD为0.62%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 同一对照品溶液在放置0、2、4、8、12、24 h后，精密吸取10 μL进样分析，测定其峰面积值，计算RSD为0.57%。表明供试品溶液24 h内基本稳定。

2.1.7 重复性试验 在相同条件下制备6份供试品溶液，按照2.1.3项下方法制备样品，测定盐酸小檗碱含量，RSD为0.59%，表明本分析方法重复性良好。

2.1.8 加样回收试验 在相同条件下制备6份供试品溶液，分别加50 μg对照品，按2.1.3项下方法制备样品，测定盐酸小檗碱含量，平均回收率为97.5%，RSD为0.34%，表明本方法回收率良好。

2.2 单因素考察

经查阅文献[7-12]和预试验，选择对提取工艺影响较大的因素，分别对提取时间、提取次数和液料比进行单因素考察。

2.2.1 提取时间考察 称取黄柏药材6份，每份50 g，液料比为10∶1，分别在20、30、45、60、90、120 min提取2次，滤过，合并滤液，浓缩，定容至250 mL。按2.1.1项下条件测定黄柏提取液中盐酸小檗碱含量。结果表明，在20～120 min内，提取液中盐酸小檗碱含量随提取时间的增加而增加，但在90～120 min含量增加程度不明显，故选择90 min为最佳提取时间。

2.2.2 料液比考察 称取黄柏药材6份，每份50 g，液料比分别为4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1，提取时间为90 min，提取2次，滤过，合并滤液，浓缩，定容至250 mL，按2.1.1项下条件测定盐酸小檗碱含量。结果表明，提取液中盐酸小檗碱的含量随料液比的增大而增大，但当液料比大于8∶1时，提取液中盐酸小檗碱含量的增幅较小，而且液料比过大，溶剂用量和浓缩工艺的能耗都会增大，因此选择8∶1为最佳液料比。

2.2.3 提取次数考察 取黄柏药材3份，每份50 g，液料比为8∶1，提取时间为90 min，提取次数分别为1、2、3次，滤过，合并滤液，浓缩，定容至250 mL，按2.1.1项下条件测定盐酸小檗碱含量。结果表明，提取液中盐酸小檗碱含量随提取次数的增加而增加。经统计学分析，提取2次与3次所得的提取液中盐酸小檗碱的含量差异无统计学意义，故选择提取2次为最佳提取次数。

2.3 星点设计-响应面优化与试验结果

在单因素试验结果的基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，以显著影响黄柏提取效果的3个因素：提取时间、液料比、提取次数为自变量(分别以A、B、C表示)，作变换如下：A=(t-90)/30，B=(z-8)/2，C=(T-2)/1(t、z、T分别为试验提取时间、液料比及提取次数)，以盐酸小檗碱得率(Y)为响应值，设计3因素3水平共17个试验点的响应面分析试验，试验以随机次序进行。响应面分析因素与水平设计见表1，其中编号为13～17的试验为5次重复的中心点试验，用来考察模型的误差。试验设计与结果见表2。

表1 星点设计因素水平编码表

表2 响应面试验设计与结果

用ANOVA分析响应面的回归参数。由表3可知，一次项A

表3 方差分析表

注：***差异极显著(P<0.000 1)；**差异高度显著(P<0.001)；*差异显著(P<0.05)。

从表3的方差分析结果可知，试验中选用的模型P<0.000 1，说明模型达到极显著水平，失拟项F值为0.153 9，影响不显著，说明该回归方程对试验拟合情况很好，能较好地起到预测作用，在所选试验条件下，各因素对盐酸小檗碱得率的影响显著(r=0.999 7)。此外，该模型的变异系数(CV=4.78%)<5%，在可接受范围内。

2.4 提取工艺的响应面分析与优化

采用Design-Expert软件[13]，根据二次回归方程绘制相应的等高线图和自变量对因变量的三维曲面图，分别将其中一个因素固定在中心值，以综合评分(Y)对另外两个因素描绘三维图。各因素交互作用的等高线图和响应面图见图1～2。对回归方程取一阶偏导数等于零，整理可得如下公式：

2.73-1.48B-0.4C-23.02A=0

公式(1)

0.24-1.48A+0.68C-15.58B=0

公式(2)

1.28-0.4A+0.68B-1.16C=0

公式(3)

联立方程组，解得A=0.096 088，B=0.052 445，C=1.057 8，代入前述的变换公式得到提取时间t=92.882 64，液料比z=8.104 89，提取次数T=3.057 8，即黄柏的最佳提取工艺条件：提取时间为92.882 64 min、液料比为8.104 89∶1、提取次数为3.057 8。但考虑到实际情况最佳提取工艺条件修正如下：提取时间为90 min，提取次数为3次，液料比为8∶1，在此工艺条件下黄柏提取液中盐酸小檗碱得率为31.7 mg·g-1。

图1 两两交互作用对盐酸小檗碱得率影响的等高线

图2 两两交互作用对盐酸小檗碱得率影响的响应面图

2.5 工艺验证试验

按照2.4项下的最佳工艺进行验证试验(n=3)，黄柏提取液中盐酸小檗碱的实际平均质量分数为32.15 mg·g-1(预测值为31.70 mg·g-1)，RSD为0.2%。试验值与理论值偏差较小，说明本试验中利用星点设计-响应面法优化得到数学模型可靠，具有良好的预测性，所得的工艺参数准确可信，具有较强的应用价值。

3 讨论

本试验通过用星点设计-响应面法优化黄柏的提取工艺，建立了影响因素与有效成分提取率间的数学模型方程，最终确定了黄柏的最佳提取工艺：提取时间为90 min，提取次数为3次，液料比为8∶1。最佳工艺下盐酸小檗碱的得率为32.15 mg·g-1，与预测值(31.70 mg·g-1)的RSD为0.2%，说明该数学模型方程与实际情况拟合很好，具有良好的预测性。因此用星点设计-响应面法优化黄柏的提取工艺是可靠的，且合理可行。

[1] 中国科学院植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1997.

[2] 王浴生，邓文龙，薛春生.中药药理与应用[M].北京：人民卫生出版社，1998：1024-1026.

[3] 王本祥.现代中药药理学[M].北京：人民卫生出版社，2000：310-311.

[4] 蒋国良，吴珂.黄柏提取工艺的优化[J].医药导报，2007，26(7)：792-793.

[5] 栾军.现代试验设计优化方法[M].上海：上海交通大学出版社，1995：191.

[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：286.

[7] 龙凤来，唐柳，余鸽，等.黄柏提取工艺研究[J].杨凌职业技术学院学报，2009，8(2)：6-8.

[8] 王景媛，王昌利，史亚军.星点设计-效应面法优化复方龙脉宁滴丸提取工艺[J].中南药学，2013，11(3)：743-747.

[9] 白曼，马丽娜，张小飞，等.星点设计-响应面分析法优选穿山龙总皂苷提取工艺[J].中南药学，2013，11(1)：4-7.

[10] 陈卫卫，徐冬英，邓超澄，等.星点设计-效应面法优选胃宁分散片的提取工艺[J].中成药，2009，31(1)：39-43.

[11] 王秋红，苏阳，吴伦，等.星点设计-效应面法优化升麻提取工艺[J].中国实验方剂学志，2012，18(1)：24-27.

[12] 毛祖林，李晓波，龚文明，等.人参皂苷提取工艺优选[J].时珍国医国药，2008，19(11)：2762-2763.

[13] 谢蓉，郭东艳，宋忠兴，等.Box-Behnken效应面法优化淫羊藿配方颗粒提取工艺[J].现代中医药，2012，32(5)：71-75.

Optimization of Extraction Process of Cortex Phellodendri Chinensis by Central Composite Design-response Surface Methodology

WU Jing1,2,3，SONG Zhongxing1,4，GU Chuan1,2,3，LIU Hongbo1,2,3，ZHAI Sicheng1,2,3，TANG Zhishu1,2,3*

(1.ShaanxiUniversityofChineseMedicine/ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，Shaanxi，Xianyang712046，China；2.ShaanxiprovincekeylaboratoryofnewdrugsandChinesemedicinefoundationresearch，Shaanxi，Xianyang712046，China；3.ShaanxirheumatismandtumorcenterofTCMengineeringtechnologyresearch，Shaanxi，Xianyang712046，China；4.ShaanxiXingshengdePharmaceuticalCo.，Ltd.，Shaanxi，Tongchuan727031，China)

Objective：To optimize extraction process of Cortex Phellodendri Chinensis by central composite design-response surface methodology.Methods：Water was chose as the extraction solvent and the effect of three factors such as solvent-solid ratio，extraction time and times was designed by Box-Behnken central composite，taking the content of berberine hydrochloride as evaluation indicator.Extraction process was optimized by central composite design-response surface methodology.Results：The optimizing extraction process of Cortex Phellodendri Chinensis were as follows：ratio of liquid to solid was 8：1，extraction repeated 3 times，90 minutes every time.The yield of berberine hydrochloride under this condition was 32.15 mg·g-1.Conclusion：Optimizing extraction process of Cortex Phellodendri Chinensis by central composite design-response surface methodology is reasonable，simple，and has good predictability.

Central composite design-response surface methodology；Cortex Phellodendri Chinensis；process optimization

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.9.016

国家自然科学基金资助项目(81373978)；陕西省重点科技创新团队资助项目(2012KCT-20)

*

唐志书，教授，研究方向：中药高新制备技术应用、中药资源开发与综合利用研究；Tel：(029)38180560，E-mail：tzs6565@163.com