慢性HBV感染者外周血Treg水平与HBV－DNA载量的相关性研究

詹爱琴，杜美玲，左维泽，程　丽，朱庆峰，季　榕，买力坎木，程光海，居马百克，谢松松，张　砚

·论著·

慢性HBV感染者外周血Treg水平与HBV－DNA载量的相关性研究

詹爱琴，杜美玲，左维泽，程丽，朱庆峰，季榕，买力坎木，程光海，居马百克，谢松松，张砚

目的探讨慢性HBV感染者外周血CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)水平与HBV－DNA载量的相关性。方法选取2013年1月—2014年12月石河子大学医学院第一附属医院感染科收治的住院和门诊慢性HBV感染者100例，其中轻中度慢性乙型肝炎(CHBLM)组43例、乙型肝炎肝硬化(LC)组27例、慢性重型乙型肝炎(CSHB)组30例;选取同期该院健康体检者36例为健康对照(HC)组。采用实时荧光定量聚合酶链反应法(FQ－PCR)检测HBV－DNA载量，采用流式细胞仪检测Treg水平。外周血Treg水平与HBV－DNA载量的相关性采用Pearson相关分析。结果CHBLM、LC、CSHB组的HBV－DNA载量比较，差异有统计学意义(F=4.564，P＜0.05);两两比较显示，CHBLM组与LC组间差异有统计学意义(P＜0.05)，其他组间差异无统计学意义(P＞0.05)。CHBLM、LC、CSHB、HC组的Treg水平比较，差异有统计学意义(F=25.218，P＜0.05);组间两两比较显示，组间差异均有统计学意义(P＜0.05)。CHBLM、LC、CSHB组外周血Treg水平与HBV－DNA载量均呈正相关(r值分别为0.458、0.697、0.544，P＜0.05)。结论慢性HBV感染者Treg水平增加，Treg水平与HBV－DNA载量呈正相关。提示Treg在慢性HBV感染中担负着重要的免疫调节作用，可能抑制HBV感染者特异性细胞免疫反应，与HBV感染的慢性化及肝病的临床发生、发展有关。

调节性T细胞;HBV－DNA;HBV感染

詹爱琴，杜美玲，左维泽，等.慢性HBV感染者外周血Treg水平与HBV－DNA载量的相关性研究［J］．中国全科医学，2015，18(25):3439－3442.［www.chinagp.net］

Zhan AQ，Du ML，Zuo WZ，et al．Correlation between regulatory T cell level in the peripheral blood and HBV－DNA load of patients with chronic hepatitis B virus infection［J］．Chinese General Practice，2015，18(25):3439－3442.

HBV感染后可能发展为慢性HBV携带、慢性肝炎、肝硬化、肝癌，其病情容易慢性化，发病机制复杂且至今尚未完全阐明，目前认为除与HBV的直接作用有关外，也与宿主免疫应答调控的紊乱、体内缺乏特异性抗病毒免疫关系密切，宿主的免疫应答同时导致了肝细胞的损伤和病毒的清除两个方面，这可能是HBV感染后导致慢性肝损伤的主要原因。近年来研究发现，CD4+T细胞可以分化为CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)，Treg具有免疫抑制作用［1］，参与HBV感染后机体免疫耐受机制，与慢性乙型肝炎发病有密切关系［2］。本研究探讨了慢性HBV感染者外周血Treg水平与HBV－DNA载量的相关性，以期了解Treg在慢性HBV感染发病机制中的作用，为慢性肝病的诊断及减少肝硬化、肝癌的发生提供分子生物学依据。

1　对象与方法

1.1研究对象选取2013年1月—2014年12月石河子大学医学院第一附属医院感染科收治的住院和门诊慢性HBV感染者100例，其中轻中度慢性乙型肝炎(CHBLM)组43例、乙型肝炎肝硬化(LC)组27例、慢性重型乙型肝炎(CSHB)组30例。所有患者的诊断符合中华医学会肝病学分会和感染病学分会2010年联合制定的《慢性乙型肝炎防治指南》［3］。排除甲、丙、丁、戊等病毒性肝炎，酒精性肝炎，脂肪肝，自身免疫性肝炎，遗传性肝病，肾功能不全及恶性肿瘤。选取同期该院健康体检者36例为健康对照(HC)组。本研究通过该院伦理委员会审核，患者均知情同意。

1.2研究方法(1)乙型肝炎抗原抗体的检测:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)，由专职检验师严格按照荷兰理利公司提供的试剂盒说明书进行操作。(2) HBV－DNA的定量检测:采用实时荧光定量聚合酶链反应法(FQ－PCR)，严格按照广州达安公司提供的试剂盒说明书进行操作。(3)Treg水平的检测:采集所有受试者外周静脉血5 ml，肝素抗凝(1 h内进行检测)。取2个流式试管，分别加入抗人CD4－FITC/CD25－PE及其同型对照IgG2b－FITC/IgG1－PE各10 μl，各管再加入50 μl新鲜抗凝全血，混匀，室温避光孵育30 min，加入固定剂50 μl，室温避光放置10 min后用1.5 ml免洗红细胞裂解液裂解10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次后，采用流式细胞仪检测。其中抗人CD4－FITC、CD25－PE、IgG2b－FITC、IgG1－PE均购于天津协科生物技术有限公司，固定剂、免洗红细胞裂解液、流式细胞仪购于德国Partec公司。采用FloMax专用软件获取及分析，计算Treg占CD4淋巴细胞的比例。

1.3统计学方法采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计量资料以(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验;计数资料比较采用χ2检验;慢性HBV感染者外周血Treg水平与HBV－DNA载量的相关性分析采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组一般情况比较CHBLM、LC、CSHB、HC组的年龄、性别比较，差异均无统计学意义(P＞0.05); CHBLM、LC、CSHB组的HBeAg阳性率、HBV－DNA阳性率比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。

CHBLM、LC、CSHB组的HBV－DNA载量比较，差异有统计学意义(P＜0.05);两两比较显示，CHBLM组与LC组间差异有统计学意义(q=4.026，P＜0.05)，其他组间差异均无统计学意义(P＞0.05，见表1)。

表1　各组一般情况比较Table 1Comparison of general information among the three groups

2.2各组外周血Treg水平比较CHBLM、LC、CSHB、HC组的Treg水平比较，差异有统计学意义(F =25.218，P＜0.05，见表2);组间两两比较显示，组间差异均有统计学意义(P＜0.05，见表3)。

2.3各组外周血Treg水平与HBV－DNA载量的相关性CHBLM组外周血Treg水平与HBV－DNA载量呈正相关(r=0.458，P＜0.05，见图1);LC组外周血Treg水平与HBV－DNA载量呈正相关(r=0.697，P＜0.05，见图2);CSHB组外周血Treg水平与HBV－DNA载量呈正相关(r=0.544，P＜0.05，见图3)。

表2　各组外周血Treg水平比较(±s，%)Table 2Comparison of Treg level in peripheral blood among the four groups

表2　各组外周血Treg水平比较(±s，%)Table 2Comparison of Treg level in peripheral blood among the four groups

注:Treg=CD4+CD25+调节性T细胞

组别例数Treg 水平CHBLM组368.12±2.80 439.23±3.30 LC组2710.35±3.21 CSHB组3011.95±3.26 HC组

表3　外周血Treg水平的组间两两比较结果Table 3Pairwise comparison of Treg level in peripheral blood

图1　CHBLM组Treg水平与HBV－DNA载量相关性的散点图Figure 1Scatterplot of correlation between Treg level and HBV－DNA load in CHBLM group

3　讨论

Treg是具有免疫调节功能的一种细胞亚群，它的作用表现在两个方面:一方面，在机体受到病原微生物感染时，Treg可以抑制机体的免疫反应，避免过度的免疫病理损害;另一方面，Treg不利于病原体的清除，导致感染持续存在。Treg的发现使人们对免疫调节和免疫耐受有了新的认识，机体可能更主要的是通过Treg以“主动”的方式维持自身免疫耐受，其在抑制自身免疫性T细胞增殖、免疫稳定方面有重要作用。在慢性HBV感染者中，Treg水平增高可能会抑制机体细胞免疫功能，导致免疫耐受，HBV感染持续存在，而HBV的持续存在与复制，是慢性乙型肝炎进展为肝硬化、肝细胞癌的主要因素。

图2　LC组Treg水平与HBV－DNA载量相关性的散点图Figure 2Scatterplot of correlation between Treg level and HBV－DNA load in LC group

图3　CSHB组Treg水平与HBV－DNA载量相关性的散点图Figure 3Scatterplot of correlation between Treg level and HBV－DNA load in CSHB group

人体感染HBV后，多数成人可以呈急性自限性感染，机体能迅速彻底清除病毒;约有10%的成人和90%的儿童感染HBV后，HBV在体内长期存在并不断复制，成为慢性HBV携带者［4］。HBV感染后慢性化的机制比较复杂，其中机体免疫能力在HBV清除过程中起到关键作用，它既要清除HBV，又要抑制HBV的复制，达到临床治愈的目的，免疫反应是一把双刃剑，在清除病毒的同时，也可能引起肝细胞坏死和凋亡，临床出现重型肝炎或者导致炎性损伤迁延不愈、肝纤维化发生，甚至发展为肝硬化、肝癌等，但其中免疫发生机制尚不清楚［5－6］。本研究结果显示，LC组患者的HBV－DNA载量低于CHBLM组，考虑符合上述机制。在长期病程中，机体免疫力在清除病毒、抑制病毒复制的同时也引起肝细胞不断出现炎症、坏死、纤维化［7］。

随着Treg在肝脏疾病中的研究逐渐成为热点，其越来越多的方面逐渐得到深入研究［8］。近年来发现Treg具有免疫低反应性和免疫抑制性两大功能特征，其机制可能是通过细胞间直接接触和/或分泌抑制性细胞因子，在维持机体免疫内环境稳定、防止自身免疫性疾病发生、诱导移植耐受以及调节肿瘤免疫方面都起着重要作用。本研究中CHBLM、CSHB、LC组中Treg水平均高于HC组，CSHB组最高，考虑可能与Treg能降低和T细胞增殖及其功能活性，减少干扰素γ (INF－γ)的产生，避免肝细胞大量的变性、坏死甚至凋亡有关。同时，由于、T效应细胞功能受到抑制与INF－γ产生不足，机体产生的抗HBV特异性免疫应答低下，仅部分HBV得到清除，临床出现免疫耐受阶段，导致HBV感染的慢性化。近年许多学者对Treg在慢性HBV感染中的作用、其免疫调节机制及其与临床病程的相关性还存在一些争议，本研究显示，Treg可能是HBV免疫逃逸产生的重要机制，从而导致持续感染［9］。

本研究结果显示，慢性HBV感染者外周血Treg水平与HBV－DNA载量呈正相关，病毒复制越活跃的患者体内Treg的水平越高，可能是体内Treg数量或功能异常，降低了机体对HBV特异性的效应细胞毒性T细胞应答，使得病毒不能被彻底清除，形成一种免疫耐受状态［10－11］。同时也防止机体抗病毒免疫反应过于强烈，引起肝细胞坏死和凋亡，临床出现重型肝炎。这就说明Treg的免疫抑制效应在HBV的复制过程中起了一定的作用，Treg的数量和功能可能为治疗HBV感染提供一个新途径。

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Correlation Between Regulatory T Cell Level in the Peripheral Blood and HBV－DNA Load of Patients With Chronic Hepatitis B Virus Infection

ZHAN Ai－qin，DU Mei－ling，ZUO Wei－ze，et al.Department of Infectious Disease，First Affiliated Hospital，School of Medicine，Shihezi University，Shihezi 832000，China

Objective To explore the correlation between CD4+CD25+regulatory T cell(Treg)level in the peripheral blood and HBV－DNA load of patients with hepatitis B virus infection.MethodsWe enrolled 100 HBV inpatients and outpatients in the First Affiliated Hospital of the Medical College of Shihezi University between January 2013 to December 2014.Among the subjects，43 were assigned into light－medium chronic hepatitis B(CHBLM)group，27 were assigned into hepatitis B liver cirrhosis(LC)group，and 30 were assigned into severe chronic hepatitis B(CSHB)group.We also enrolled 36 healthy people who received physical examination in the hospital in the same period as health control(HC)group.FQ－PCR was used to examine HBV－DNA load，and flow cytometry was used to test Treg level.Pearson correlation analysis was conducted to investigate the correlation between Treg level and HBV－DNA load.ResultsThere were significant differences among the three groups in HBV－DNA load(F=4.564，P＜0.05);in pairwise comparison，significant difference existed between CHBLM group and LC group(P＜0.05)，while no significant differences existed between other two groups.The four groups were significantly different in Treg level(F=25.218，P＜0.05);in pairwise comparison，significant differences existed between any two groups(P＜0.05).In CHBLM group，LC group and CSHB group，there was positive correlation between Treg level and HBV－DNA load(r values were 0.458，0.697 and 0.544 respectively，P＜0.05).ConclusionPatients with chronichepatitis B virus infection have higher Treg level，and there is positive correlation between Treg level and HBV－DNA load.Treg has important immunomodulatory effects on chronic hepatitis B virus infection and may inhibit the specific cellular immune response，and it is related with the chronicity of HBV infection and the clinical application and development of liver diseases.

Regulatory T cell;HBV－DNA;Hepatitis B virus infection

R 512.62

A

10.3969/j.issn.1007－9572.2015.25.014

2015－06－10;

2015－08－03)

(本文编辑:闫行敏)

832000新疆石河子市，石河子大学医学院第一附属医院感染科(詹爱琴，左维泽，程丽，朱庆峰，季榕，买力坎木，程光海，居马百克，谢松松，张砚);新疆兵团第九师医院感染科(杜美玲)

詹爱琴，832000新疆石河子市，石河子大学医学院第一附属医院感染科;E－mail:403957842@qq.com