维吾尔药异常黑胆质成熟剂总黄酮对增生性瘢痕成纤维细胞增殖及胶原蛋白表达的影响

李加辅，朱瑞祥，许言文，钱　璇，马少林

（新疆医科大学第一附属医院烧伤整形科　新疆　乌鲁木齐　830054）

·基础研究·

维吾尔药异常黑胆质成熟剂总黄酮对增生性瘢痕成纤维细胞增殖及胶原蛋白表达的影响

李加辅，朱瑞祥，许言文，钱璇，马少林

（新疆医科大学第一附属医院烧伤整形科新疆乌鲁木齐830054）

目的：探讨维吾尔药异常黑胆质成熟剂总黄酮（Abnormal savda munziq-total flavonoids，ASMq-TF）对体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞（Hypertrophic scar fibroblasts，HFs）增殖抑制作用及对相关胶原蛋白合成的影响。方法：对HFs进行体外培养并给予不同浓度的ASMq-TF处理，然后，通过CCK-8检测其细胞增殖情况，通过RT-PCR和Western blot实验检测相关胶原蛋白表达。结果：ASMq-TF能够显著抑制HFs的增殖及抑制胶原蛋白的表达。讨论：本实验结果表明ASMq-TF通过促进SMAD7合成及减少CollagenⅠ分泌等抑制HFs增殖。［关键词］异常黑胆质成熟剂总黄酮；增生性瘢痕；成纤维细胞；体外培养；胶原蛋白；增殖

创面愈合是一个由多种细胞及细胞因子参与的即复杂又有高度协调性的过程，大概可以分为三个过程：炎症期、肉芽组织形成期及重建期，且任何环节出错都会导致不良后果：①创面延迟愈合；②增生性瘢痕；③瘢痕疙瘩[1-4]。增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS）作为一种诸如外伤、烧伤、外科手术等创面的过度愈合，越来越多的证据都指出其发病机制和成纤维细胞的过度增殖，侵袭性加强，胶原蛋白合成增加有关[5-8]。维药异常黑胆质成熟剂总黄酮（Abnormal savda munziq-total flavonoids，ASMq-TF）是从维药异常黑胆质成熟剂（Abnormal savda munziq，ASMq）中提取的活性成分[9]。以往的研究结果表明，ASMq具有抑制成纤维细胞增殖，促进其凋亡等作用，可以减轻肝纤维化、肺纤维化等纤维化疾病。国内外已有很多报道，多种黄酮类化合物具有抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡作用[10-14]。因此本文研究ASMq-TF对HFs的增殖和胶原的合成是否具有抑制作用，旨在进一步解释ASMq对瘢痕的抑制作用，从而为维药在临床预防和治疗HS提供相应的理论基础。

表2　相关引物

1　材料和方法

1.1试剂和化学品

异常黑胆质成熟剂购于新疆维吾尔药业有限责任公司（国药准字：Z65020166），并经水提取分离得到总黄酮（含量为1.62%）；培养基（DMEM），胎牛血清（FBS），胰酶，PBS缓冲液，青霉素和链霉素购自于美国Hyclone公司；二甲基亚矾（DMSO）购自美国Sigma-Aldrich公司；细胞增殖及细胞毒性试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8购自于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞来源

本实验所用5块HS组织（其中男3例、女2例，均为汉族，年龄23～44岁。平均31.4岁）均来源于整形外科术后切除组织，经病理检查确诊为HS。本实验中所有患者均无系统性疾病，同时本实验经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审议通过，所有提供标本患者均签署知情同意书。

1.3细胞培养及处理

将术中切取的组织标本，在超净台内以无菌PBS液漂洗2遍，去除残留的血液及其他混杂异物，小心仔细的切除表皮及脂肪组织，将组织标本修剪成小块，均匀接种于100mm细胞培养皿（美国Corning公司），而后缓慢加入含胎牛血清（体积分数10%）及青霉素（100U/ml）和链霉素（100μg/ml）的DMEM培养液，于37℃，含CO2（体积分数为5%）及饱和湿度条件下的培养箱中培养，每3～4d更换一次培养基。大约7～9d成纤维细胞从组织块周围爬出，待组织块周围细胞长成致密单层后，取出培养皿中组织块并用胰酶将细胞消化并进行传代培养，选择3～6代的细胞用于实验研究。在笔者以下的实验中HFs在加药干预前均经过无血清DMEM 24h均一化处理，然后在加入含10%FBS的DMEM进行下面的实验。

1.3.1细胞分组：将处于对数生长期的3～6代的HFs分为：①空白对照组：加入等体积的培养液；②实验组：分别加入浓度为320、340、360、380、400μg/ml的ASMq-TF；③阳性对照组：加入浓度为250μg/ml的5-FU氟尿嘧啶（5-FU）。每组设 3个平行复孔，以便观察与检测。各组于加药48h后进行观察及实验。

1.3.2 CCK-8法检测ASMq-TF、5-FU对细胞增殖的抑制作用：对处于对数生长期的细胞进行计数，HFs经传代后以5×103个/孔细胞数接种于96孔板中，并加入200μl含10%FBS的DMEM培养，待细胞贴壁后用无血清的DMEM饥饿过夜进行均一化处理；根据实验分组设计，加药干预细胞，每组设3个复孔。连续检测加药后第1天至第11天同一时间点的各组细胞增殖情况，于检测前4h每孔各加入20μl的CCK-8工作液，置于37℃、体积分数5%的CO2培养箱中孵育4h后用酶标仪读取各孔在490nm处光波波长的吸光值（OD值），实验重复3次，取平均值，后绘制各组的HFs的生长曲线。

1.3.3逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）：将HFs以5×104个接种在60mm培养皿中，经预设方法干预24h后应用Trizol（美国TriPure Isolation Reagent公司）液裂解细胞，后经氯仿、异丙醇进一步提取经过处理的成纤维细胞总mRNA，用紫外分光光度仪分别测定波长为260nm和280nm的光密度值，确定RNA含量和纯度。相关引物设计如下（详见表2），用反转录试剂盒（美国Thermo公司）进行cDNA的合成，PCR扩增产物10μl在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳，而后对凝胶进行图像的采集，用Photoshop读取灰度值。

1.3.4 Western blot检测Smad7及胶原的表达：将实验细胞以2×105个接种于直径为10cm的培养皿中，加入不同药物培养后，使用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo公司）对提取的总蛋白进行定量，后对蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），在将蛋白转移到PVDF膜（美国Roche公司）上并用5%的脱脂奶粉封闭，相关一抗如下：Collagen I、SMAD7、GAPDH（美国Santa Cruz公司），用BCA蛋白定量分析试剂盒（美国Pierce公司）对一抗孵育后的PVDF膜进行二抗孵育及化学显色，最后用Quantity One软件（美国Bio-Rad公司）采集图像，用Photoshop读取灰度值。

1.4统计学分析

统计软件采用SPSS 11.5，实验所得数据以x±s表示，各组间比较采用t检验，实验所得数据以表示，P＜0.05为差异有显著性意义。

2　结果

2.1 CCK-8检测HFs的增殖活性

图1　CCK8法检测不同处理组HFs的增殖情况

图2　RT-PCR检测CollagenⅠmRNA表达情况

图3　RT-PCR检测SMAD7 mRNA表达情况

见图1，可以看出：与空白对照组相比，不同浓度ASMq-TF组及5-Fu组的HFs增殖活性明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。空白对照组OD值在第10天达到检测上限值3.5，随着实验组药物浓度增加，对HFs的抑制作用增强，在320～400μg/ml浓度间具有药物浓度依赖性。空白对照组细胞总数在第10天达到平台期，320μg/ml ASMq-TF组在第10天达到平台期，但其细胞总数较空白对照组少。340μg/mlASMq-TF组细胞数在第7天开始下降，360μg/mlASMq-TF组在第6天开始有所减少，380μg/mlASMq-TF组在第 5天即开始减少；400μg/mlASMq-TF组在第3d即开始减少；5-Fu组在第2天开始减少。实验表明，ASMq-TF和5-Fu作用类似，对HFs具有增殖抑制作用，这一抑制作用表现出浓度时间依赖性（P＜0.05），和空白对照组相比，ASMq-TF浓度为340～380μg/ml时抑制作用较明显（P＜0.05）。

2.2 RT-PCR检测各预设组HFs相关mRNA水平变化

见图2、3。图2及图3表明：实验组和空白对照组相比，ASMq-TF能抑制CollagenⅠmRNA水平的表达、促进SMAD7 mRNA的表达，且都具有浓度依赖性（P＜0.05）。实验组和阳性对照组表明：本实验中ASMq-TF和5-Fu在CollagenⅠmRNA的表达水平上表现出相似的抑制作用，同时两者对SMAD7 mRNA的表达都具有促进作用。

2.3 Western blot检测不同处理组相关蛋白的表达水平

见图4、5。如图4所示：和空白对照组相比实验组ASMq-TF表现出和阳性对照组类似的抑制HFs CollagenⅠ蛋白表达的作用（P＜0.05）。相对于空白对照组，实验组中ASMq-TF能够上调HFs SMAD7蛋白的表达水平（P＜0.05），且具有浓度依赖性；阳性对照组表现出实验组类似的作用（P＜0.05），见图5。

图4　Western blot检测各组CollagenⅠ蛋白表达情况

图5　Western blot检测实验各组SMAD7蛋白表达情况

3　讨论

HS是一种以成纤维细胞过度增殖和以胶原蛋白为主的细胞外基质过度表达为特点的一种常见皮肤疾病，严重影响患者的美观甚至心理健康，而目前临床上尚没有单一的药物能够完全防治瘢痕的增生[15]。笔者的实验通过研究ASMq-TF对于HFs的作用，从而为防治增生性瘢痕提出一种新的方法或途径。

AMSq是维吾尔医药的重要组成部分，由菊苣子、芹菜根、菊苣根、香青兰子、黑种草子、茴香根皮、洋甘菊、甘草、香茅、罗勒子、蜀葵子、茴芹果、骆驼蓬子等13味维药调制而成。随着维吾尔医学对药理学和药效学的不断研究，ASMq已逐渐得到了越来越多的关注，有研究表明，ASMq-TF对肝癌、淋巴瘤、乳腺癌等肿瘤细胞有明显的抑制作用；并可以转逆肝癌耐药细胞株Bel/Fu多药耐药性，从而抑制癌细胞的增生[12]。本实验对离体成纤维体细胞培养证实ASMq-TF能够显著抑制HFs的增殖，增加SMAD7的表达及显著降低I型胶原的合成。

SMAD7是一种抑制型蛋白，它能够阻止SMAD2及SMAD3的磷酸化，进而抑制HFs增殖及降低CollagenⅠ的合成[16]。在目前的研究中笔者发现ASMq-TF能够明显增加HFs中SMAD7的表达，提示部分阻断TGF-β/SMAD通路可能是ASMq-TF的作用机制之一，然而具体机制尚有待于更深一步的研究。

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编辑/张惠娟

Effects of total flavone of abnormal savda munziq on the proliferation and collagen synthesis of hypertrophic scar fibroblasts

LI Jia-fu，ZHU Rui-xiang，XU Yan-wen，QIAN-Xuan，MA Shao-lin
（Department of Burns and Plastic Surgery，The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，Xinjiang，China）

Objective To evaluate in vitro effect of Abnormal savda munziq-total flavonoids on the proliferation and collagen synthesis of human hypertrophic scar fibroblasts（HFs）.Methods HFs was cultured in vitro and treated with different concentrations of ASMq-TF.Then，the cell proliferation was detected by CCK-8.The expression of collagen was detected by RT-PCR and Western blot.Results ASMq-TF can inhibit the proliferation of HFs and inhibit the expression of collagen proteinⅠ. Conclusion The results of this experiment showed that ASMq-TF inhibited the proliferation of HFs by promoting SMAD7 synthesis and reducing Collagen secretionⅠ.

Abnormal savda munziq-total flavonoids；hypertrophic scar；fibroblasts；in vitro；collagen；proliferation

R619+.6

A

1008-6455（2015）23-0031-05

国家自然科学基金，维药异常黑胆质成熟剂基于TGF-β/Smad通路防治增生性瘢痕机制研究（项目编号：81260291）

马少林，主任，教授，博士研究生导师；研究方向：增生性瘢痕防治，组织器官缺损修复再造；通信地址：新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市鲤鱼山路137号，新疆医科大学第一附属医院烧伤整形科，邮编：830054

2015-09-18

2015-11-27