妊娠早期基于游离胎儿细胞DNA检测非整倍性染色体的研究进展

马冬，佟文秀，张艳梅，姜杰，李琪，李鸥

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妊娠早期基于游离胎儿细胞DNA检测非整倍性染色体的研究进展

马冬，佟文秀，张艳梅，姜杰，李琪，李鸥

非整倍性染色体是围生期发病率和死亡率的主要原因。在妊娠早期，以较低的检测成本实现最大限度的检测率和最低的假阳性率，且减少不必要的侵入是产前筛查方法的主要目的。除血清学、超声学及综合筛查方法外，利用母体血浆中游离胎儿细胞DNA(cffDNA)建立的无创基因检测方法具有更加快速、准确的特点，愈来愈受到重视。本文就非整倍性染色体异常的基因检测方法研究进展做一综述，以期为有效地控制染色体异常患儿的出生和提高人口素质提供有力技术支撑。

产前诊断;染色体畸变;无创产前DNA检测;游离胎儿细胞DNA

马冬，佟文秀，张艳梅，等.妊娠早期基于游离胎儿细胞DNA检测非整倍性染色体的研究进展［J］．中国全科医学，2015，18(30):3732－3735.［www.chinagp.net］

Ma D，TongWX，Zhang YM，et al.Research progress of aneuploidy detection based on cell－free fetal DNA in the first trimster of pregnancy［J］．Chinese General Practice，2015，18(30):3732－3735.

染色体异常综合征患者具有严重的智力和生理缺陷，发病率高且无法治疗。染色体病通常包括染色体数目异常和染色体结构异常，前者占存活新生儿的1/150～1/120［1］，且以非整倍性染色体最为常见。最常见的非整倍性染色体活产儿包括21三体综合征、13与18三体综合征、特纳综合征及Klinefelter综合征。目前，除通过染色体病产前筛查和诊断终止染色体异常新生儿出生外，仍无其他有效预防和治疗方法［2］。因此，为提高出生人口素质，妊娠妇女均应接受胎儿非整倍性染色体产前筛查。

1997年，Lo等［3］研究发现，在妊娠妇女血浆中存在游离胎儿细胞DNA(cell－free fetal DNA，cffDNA)，其水平较胎儿有核红细胞丰富，且随着妊娠进程而增加，在妊娠妇女血液中出现时间早且产后迅速清除。由于cffDNA提供了全面分析胎儿发育、生理功能以及病理分子机制的可能，并具有快速降解的特性，使其成为产前无创检测的最优指标［4］。2010年，Lo等［5］的研究进一步证明了，妊娠妇女外周血浆存在胎儿的全基因组cffDNA序列片段，使其从理论上可以利用妊娠妇女外周血浆进行针对胎儿的几乎全部染色体检测。cffDNA检测能更早发现胎儿异常，与传统产前诊断相比具有较高的灵敏度和特异度，妊娠妇女易于接受，可有效减少对妊娠妇女身体的创伤和心理负担，所以近年来cffDNA受到广泛关注［6］。本文将目前应用cffDNA检测非整倍性染色体的研究进展进行综述，并探讨其存在的问题及发展趋势。

1 妊娠早期胎儿非整倍性染色体产前筛查

1.1 血清生化标志物筛查血清生化标志物筛查的原理是由于胎儿染色体的异常会影响胎盘功能，从而导致妊娠妇女血清生化指标异常，最终这些妊娠妇女将被筛查为高危妊娠妇女。1999年，Christiansen等［7］通过对妊娠妇女血清中多种妊娠相关标志物进行综合分析，发现在9～13孕周与妊娠相关的血浆蛋白A (PAPP－A)水平下降、人绒毛膜促性腺激素β亚单位(β－HCG)水平增高的妊娠妇女存在发生21三体综合征的风险，而仅以妊娠妇女血浆中PAPP－A水平诊断21三体综合征的灵敏度为42%，假阳性率为5%。其他妊娠早期血清生化标志物筛查指标包括:甲胎蛋白(AFP)、游离雌三醇(uE3)［8］、抑制素A(inhibin－A)［9］、胎盘生长因子(PIGF)［10］、妊娠特异性β1糖蛋白(SP1)［11］、侵袭性滋养层抗原(ITA)［12］和去整合素样金属蛋白酶(ADAM－12)［13］等。由于采用单独的血清学指标诊断胎儿非整倍性染色体的检出率不高，且具有一定的假阳性和假阴性，因此早期妊娠筛查较多的是联合指标。

1.2 产前超声标记筛查目前建议在妊娠11～14周应用产前超声标记筛查来检查胎儿颈背皮肤透明带厚度(nuchalskinfold thickness，NT)，在妊娠18～24周采用腹部超声仔细检查胎儿结构。产前超声标记筛查在多方面较血清生化标志物筛查优势明显［14］。NT已成为在妊娠早期检测染色体数目异常的最敏感的产前超声标记筛查指标，Grande等［15］最新研究表明，NT可作为妊娠早期(9～10周)检测胎儿三倍体综合征的标记顶臀长度(CRL)(28～44 mm)。其他妊娠早期超声标记筛查指标包括:鼻骨缺失、胎盘体积及早发的胎儿生长受限(FGR)、心动过缓等。尽管关于胎儿非整倍性染色体的产前超声标记筛查研究越来越多，但在日常筛查中应用超声仍面临着可靠性和质量控制的问题，且需要与妊娠中期相关指标联合筛查。Caughey等［16］研究证实，单独利用产前超声标记筛查来决定高危妊娠妇女是否行羊水穿刺，56%的21三体综合征胎儿将被漏诊。

1.3 综合筛查目前公认最常用、最有效的妊娠早期筛查方案是PAPP－A、游离β－HCG和NT联合筛查，可诊断约90%的21三体综合征胎儿，且假阳性率约为5%［17］，对18三体综合征、13三体综合征和Tuner综合征检测的灵敏度分别为89%、90%和90%［18］。尽管妊娠早期筛查指标不断被报道，但是目前仍以妊娠中期筛查指标为主要，通过对β－HCG、AFP和uE3水平进行联合检测进行分析。血清生化标志物和产前超声标记联合筛查等无创伤的筛查方式一方面灵敏度有限，另一方面又无法代替有创性产前筛查来进行胎儿遗传学疾病的诊断。

2 基于cffDNA检测非整倍性染色体

cffDNA检测用于无创性产前筛查在很大程度上会受到母源性血浆背景的影响，常规方法只能检测出父源性遗传的基因突变，对母源性遗传的检测有一定限制［19］。因此，利用妊娠妇女血浆中胎儿游离核酸检测胎儿非整倍性染色体主要通过以下3个方面进行:(1)改进提取cffDNA的方法;(2)筛查简便的胎儿特异性标志物;(3)建立直接检测胎儿非整倍性染色体的数字PCR(digital PCR)和大规模平行基因组测序(massively parallel genomic sequencing，MPGS)技术［20］。

2.1 cffDNA的特点cffDNA主要来源于胎盘滋养层细胞，且占血浆全部DNA的比例随着孕周的增大而缓慢上升。母体血浆中的cffDNA具有如下基本特性:(1)妊娠早期占母体血浆全部DNA的3%～6%［21］。(2)cffDNA水平随妊娠进展而逐渐增加，最早可于妊娠5周在妊娠妇女血浆中测出，为无创性产前诊断提供了新的可能，在很大程度上降低了妊娠妇女的身心负担。(3)妊娠妇女血浆中的cffDNA分子较母体游离DNA分子长度短很多。99%的cffDNA分子短于313 bp，其中80%的长度在193 bp以下，因此可通过DNA分子长度对cffDNA进行富集［22］。

2.2 cffDNA的提取妊娠妇女血浆中提取cffDNA的质量好坏是其检测的关键步骤。除利用改良的饱和酚提取cffDNA外，目前研究多采用QIAGEN等公司商品化试剂盒进行血浆DNA的提取(例如: QIAmp DNA Blood Mini Kit)。Huang等［23］利用DNA提取自动化系统不仅提高了cffDNA的产量和纯度，而且还能够提高PCR扩增效率。Jorgez等［24］通过DNA分子长度分级分离法和全基因组扩增(whole genome amplification，WGA)提高了cffDNA的富集效率。

2.3 cffDNA水平的测定PCR是目前检测cffDNA最常用的方法。Wataganara等［25］研究显示，PCR检测cffDNA在妊娠妇女血中的检测限为5.83 copies/m l。目前妊娠21三体综合征胎儿妊娠妇女血浆中cffDNA水平明显增加的原因可能为: (1)妊娠21三体综合征胎儿结构发育异常，胎儿与母体间的交换致使胎儿细胞进入母体增多，从而使妊娠妇女血浆中的胎儿有核红细胞明显增多，为正常的4～5倍。增多的胎儿细胞进入妊娠妇女血清后自行凋亡释放cffDNA;(2)由于胎盘滋养层细胞凋亡或胎盘重塑导致其直接释放cffDNA进入母体血液中;(3)有学者报道，在妊娠21三体综合征妊娠妇女的胎盘上发现较多的绒毛出血及未成熟的滋养层细胞，这样可能会加速胎儿与母体间的游离核酸交换，导致cffDNA水平明显增多［26］。有研究表明，妊娠13三体综合征胎儿的妊娠妇女血浆中cffDNA水平是正常妊娠妇女的1.8倍［25］。

2.4 非整倍性染色体检测自从Lo等［3］在孕有男胎的妊娠妇女血浆中检测出胎儿Y染色体特异性DNA序列之后，发现了不依赖于胎儿性别和母体血浆的胎儿特异性标志物，这为无创性产前诊断胎儿非整倍性染色体提供了可能。Nicolaides等［27］利用妊娠妇女血浆中cffDNA测序13、18、21、X、Y染色体非整倍性的SNP目标序列，可作为无创性产前筛查胎儿非整倍性染色体的方法，该技术不但精确，且不受缺乏SNP、DNA提取质量和杂合子诊断的限制，临床应用前景较大。Poon等［28］检测出妊娠妇女和胎儿DNA序列甲基化之间的差异，首次将表观遗传学标志物用于无创产前筛查。随后利用发现的18号染色体上maspin基因(SERPINB5)［29］、21号染色体上AIRE基因［30］和HLCS基因［31］启动子区域CpG位点的高度甲基化差异，成功检测了18三体综合征和21三体综合征，但是这些方法均受限于酶切位点和经亚硫酸氢钠前处理导致的DNA降解。Tong等［32］首次利用DNA的甲基化修饰和免疫共沉淀(methylated DNA immunoprecipitation methodology，MeDiP)检测技术克服了以上问题，成功诊断出14例21三体综合征和26例其他非整倍性染色体。

由于通用性标志物研究应用的局限性，近几年研究建立了digital PCR和MPGS。digital PCR即数字相对染色体计量分析，比PCR更为精确，可对cffDNA水平进行精确定量分析。其不依赖胎儿性别及遗传多态性，甚至允许有母体DNA的污染和嵌合体的存在，具有较高的临床灵敏度和较广泛的临床应用价值。Lo等［33］利用digital PCR诊断胎儿非整倍性染色体，但需要胎儿非整倍性染色体DNA水平需达到cffDNA总水平的25%以上。

采用MPGS技术，通过对妊娠妇女血浆中总DNA片段测序检测胎儿非整倍性染色体，不需要分离出cffDNA，由此可精确计算出释放在血浆中各种游离DNA的水平，经序列比对可计算出血浆中每条染色体的相对水平。如果胎儿为21三体综合征，则代表21号染色体的特异性序列在妊娠妇女血浆中存在过度表达，从而导致妊娠妇女血浆中21号染色体序列的比例小幅增加而被检测出。Chiu等［34］报道了利用GAII Analyser(Illumina)测序系统，分别采用8－重和2－重的方法检测21三体综合征，具有很高的灵敏度(分别为79.1%和98.9%)和特异度(分别为100.0%和97.9%)。Palomaki等［35］利用HiSeq 2000(Illumina)测序系统采用4－重分析法，其灵敏度和特异度分别为98.6%和99.8%。基于cffDNA检测胎儿非整倍性染色体技术发展进程见表1。

表1 基于cffDNA检测胎儿非整倍性染色体技术发展进程Table 1 Recent advances of cffDNA testing on fetal aneuploidy detection

3 小结

目前，胎儿非整倍性染色体的基本预防措施包括:(1)避免高龄妊娠;(2)对具有非整倍性染色体风险的夫妻进行妊娠前基因诊断;(3)补充叶酸。如果以上预防措施在妊娠妇女35岁前完成，可明显降低胎儿非整倍性染色体的发生。由此可见，cffDNA检测在无创产前筛查胎儿非整倍性染色体领域发展潜力巨大。但测序相关费用昂贵以及对检测结果解释需要复杂的生物信息学，为cffDNA检测的发展带来了一定的局限性。目前，虽然已有大量前瞻性临床研究，对应用cffDNA检测胎儿非整倍性染色体筛查的有效性进行了验证，但尚需大样本试验对其进行评价，以期进一步降低检测成本，提高检测效率，使cffDNA检测成为重要的产前筛査方法。

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Research Progress of Aneuploidy Detection Based on Cell－free Fetal DNA in the First Trimster of Pregnancy

MA Dong，TONG Wen－xiu，ZHANG Yan－mei，et al.North China University of Science and Technology，Hebei Coal Occupational Health and Safety Key Laboratory，Tangshan 063000，China

Aneuploidiy is a major cause for perinatal morbidity and mortality.In the first trimester of pregnancy，the main purpose of prenatal screening method is to achieve maximum detection rate and low false positive rate，and reduce unnecessary invasive procedures at a relatively low cost.Besides the serology，ultrasound and comprehensive screening method，the non－invasive gene detection method using cell－free fetal DNA(cffDNA)in maternal plasma is more rapid and accurate.In this paper，we reviewed the research progress of detection method for aneuploid chromosome abnormality，in order to effectively control the birth of infants with chromosome abnormalities and to provide technical support for the improvement of population quality.

Prenatal diagnosis;Chromosome aberrations;Non－invasive prenatal testing;Cell－free fetal DNA

R 596.1

A

10.3969/j.issn.1007－9572.2015.30.021

2015－02－21;

2015－06－16)

(本文编辑:李婷婷)

河北省自然科学基金资助项目(H2014105093)

063000河北省唐山市，华北理工大学，河北省煤炭职业卫生与安全重点实验室(马冬，李琪);唐山工人医院妇产科(佟文秀，张艳梅，姜杰，李鸥)

李鸥，063000河北省唐山市，唐山工人医院妇产科;

E－mail:tsliou@163.com