维生素D结合蛋白基因rs2282679 A/C多态性与慢性阻塞性肺疾病的相关性研究

王美芹，张建志，王莉

维生素D结合蛋白基因rs2282679 A/C多态性与慢性阻塞性肺疾病的相关性研究

王美芹，张建志，王莉

目的探讨维生素D结合蛋白(VDBP)基因rs2282679 A/C多态性与慢性阻塞性肺疾病(COPD)的相关性。方法选取2012年3月—2014年5月衡水市哈励逊国际和平医院住院治疗的男性COPD患者120例为COPD组，另选取同时期衡水市疾病预防控制中心体检健康男性112例为对照组，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清25羟维生素D〔25(OH)D〕水平，采用TaqMan－聚合酶链反应检测VDBP基因rs2282679 A/C等位基因频率及基因型分布。结果对照组25(OH)D水平(55.1±5.8)nmol/L高于COPD组的(37.3±2.3)nmol/L(t=31.220，P＜0.001)。对照组与COPD组VDBP基因rs2282679 A/C等位基因频率与基因型分布比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。对照组与COPD组AA、AC、CC基因型者组间25(OH)D水平比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。对照组和COPD组组内AA、AC、CC基因型者25(OH)D水平比较，差异均有统计学意义(P＜0.05);其中AC、CC基因型者低于AA基因型者，CC基因型者低于AC基因型者(P＜0.05)。调整年龄、吸烟指数后，AA基因型比AC基因型COPD易患率低18.3%〔OR=0.374，95%CI(0.197，0.708)，P=0.002〕;AA基因型比CC基因型COPD易患率低35.8%〔OR=0.260，95%CI(0.106，0.640)，P=0.002〕;AC基因型比CC基因型COPD易患率低16.7%〔OR =0.201，95%CI(0.849，4.744)，P=0.109〕。结论VDBP基因rs2282679 A/C多态性与COPD具有相关性，其中CC基因型与COPD易患性、25(OH)D水平关系紧密，或可作为COPD易患性筛选的突变位点。

肺疾病，慢性阻塞性;维生素D结合蛋白质;基因;多态性，单核苷酸

王美芹，张建志，王莉.维生素D结合蛋白基因rs2282679 A/C多态性与慢性阻塞性肺疾病的相关性研究［J］．中国全科医学，2015，18(30):3678－3681.［www.chinagp.net］

Wang MQ，Zhang JZ，Wang L.Correlation between rs2282679 A/C polymorphism in vitamin D－binding protein gene and chronic obstructive pulmonary disease［J］．Chinese General Practice，2015，18(30):3678－3681.

目前，慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的发病机制尚不明确，造成的肺功能降低亦无有效干预措施，其死亡率居所有死因第4位，且呈逐年递增趋势，全球疾病负担研究项目预计到2020年COPD将为死因第3位［1］。我国对7个地区20 245名成年人的调查发现，40岁以上人群的COPD患病率高达8.2%［2］。探索COPD的发病机制是预防该病的关键。维生素D参与了COPD的慢性气道炎症过程，对人体的呼吸器官具有保护作用，其在人体内的水平与肺功能密切相关［3］。因此，近年来关于维生素D与COPD的研究成为该病防治的热点。维生素D结合蛋白(VDBP)是一种合成于肝脏的多功能血浆球蛋白，可结合并转运维生素D及其代谢物{如25羟维生素D〔25(OH)D〕、1，25－二羟维生素D3〔1，25－(OH)2D3〕}至靶器官发挥生理作用［4］。VDBP基因多态性与维生素D的水平关系密切，目前已知的基因型有124种［5］，有研究报道显示，位于第12内含子的rs2282679A/C多态性与维生素D水平相关［6］。本研究拟探讨VDBP基因rs2282679A/C多态性与25(OH)D水平、COPD易患性的关系，了解COPD的发生机制，为防治COPD提供依据与指导。

1 资料与方法

1.1 纳入与排除标准纳入标准:发病为中年，有长期吸烟或其他烟雾接触史，症状进展缓慢，存在持续性气流受限，吸入支气管舒张剂后第1秒用力呼气末容积(FEV1)/用力肺活量(FVC)＜70%［2］。排除标准:患有或合并肺炎、支气管哮喘、间质性肺疾病等影响肺功能测定结果的疾病;患有或合并肿瘤、1型糖尿病、自身免疫性疾病、心血管疾病等影响维生素D水平的慢性疾病;采血前1个月口服维生素D;入选者间有血缘关系;近6个月COPD急性发作者。

1.2 临床资料选取2012年3月—2014年5月衡水市哈励逊国际和平医院住院治疗的COPD患者120例为COPD组，均符合上述纳入与排除标准，汉族，男性，年龄42～71岁，平均年龄(63.6±10.5)岁;吸烟指数(每天吸烟支数×吸烟年数)(28.6±3.2)年支，FEV1/FVC为(61±20)%，FEV1占预计值百分比为(63±23)%。另选取同时期衡水市疾病预防控制中心体检健康男性112例为对照组，汉族，年龄40～70岁，平均年龄(62.5±9.7)岁;吸烟指数(27.4±2.0)年支，FEV1/FVC为(85±34)%，FEV1占预计值百分比为(87±24)%。两组年龄、吸烟指数比较，差异均无统计学意义(t值分别为0.827和0.196，P值分别为0.409和0.051);对照组FEV1/FVC、FEV1占预计值百分比高于COPD组，差异均有统计学意义(t值分别为6.650和45.667，P值均＜0.001)。

1.3 肺功能检测使用cosmed便携式肺功能仪(上海益联医学仪器发展有限公司)进行肺功能测定。测定前避免使用短效或长效支气管舒张剂，受试者深吸气后以爆发力快速用力用口呼吸，检测2次，取较佳者。

1.4 维生素D水平检测抽取受试者空腹外周血5 ml，2 h内－70℃冷冻保存，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测25(OH)D水平［7］。

1.5 基因组DNA提取与分型收集受试者外周血细胞，采用Qiagen试剂盒(广州健仑生物科技有限公司)提取DNA。严格按说明书操作，步骤为:预冷，充分研磨血细胞，加入缓冲液将二者混匀，2 500 r/min离心10 min(离心半径13.5 cm)、磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤、盐析、2 500 r/min离心10 min(离心半径13.5 cm)弃沉淀取上清液，加无水乙醇沉淀、12 000 r/min离心5 min(离心半径8 cm)，洗提DNA。

采用TaqMan－聚合酶链反应(PCR)法对DNA上的单核苷酸多态性位点(SNP)进行基因分型。仪器:实时荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)，采用SDS 2.3软件检测基因荧光信号确定样本的基因型。结果满足Hardy－Weinberg平衡(χ2=16.20，P=0.07)。

1.6 统计学方法使用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料符合正态分布以(±s)表示，两组间比较采用成组t检验;计数资料比较采用χ2检验或Fisher确切概率法;不同基因型与25(OH)D水平关系采用单因素方差分析，不同基因型与COPD易患率的关系采用Logistic回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组25(OH)D水平比较对照组25(OH)D水平为(55.1±5.8)nmol/L，COPD组25(OH)D水平为(37.3±2.3)nmol/L，差异有统计学意义(t =31.220，P＜0.001)。

2.2 两组等位基因频率与基因型分布比较对照组与COPD组VDBP基因rs2282679 A/C等位基因频率与基因型分布比较，差异均有统计学意义(P＜0.05，见表1)。

表1 对照组与COPD组VDBP基因rs2282679 A/C等位基因频率与基因型分布比较〔n(%)〕Table1 Comparison of allele frequency and genotype distribution of VDBP gene A/C rs2282679 between control group and COPD group

2.3 两组不同基因型者25(OH)D水平比较对照组与COPD组AA、AC、CC基因型者组间25(OH)D水平比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。对照组和COPD组AA、AC、CC基因型者组内25(OH)D水平比较，差异均有统计学意义(P＜0.05);其中AC、CC基因型者低于AA基因型者，CC基因型者低于AC基因型者，差异均有统计学意义(P＜0.05，见表2)。

表2 两组不同基因型者25(OH)D水平比较(±s，nmol/L)Table 2 Comparison of 25(OH)D level between the two groups of different genotype distribution

表2 两组不同基因型者25(OH)D水平比较(±s，nmol/L)Table 2 Comparison of 25(OH)D level between the two groups of different genotype distribution

注:25(OH)D=25羟维生素D;与AA基因型比较，aP＜0.05;与AC基因型比较，bP＜0.05

组别AA例数25(OH)D AC例数25(OH)D CC例数25(OH)D F值P值47.560＜0.001 COPD组102 41.3±3.9 15 39.6±3.1a3 36.4±2.9ab56.880＜0.001 t值对照组106 58.6±5.2 4 56.0±4.9a2 51.3±2.2ab＜0.001＜0.001＜0.001 28.936 32.840 65.964 P值

2.4 不同基因型与COPD易患性的关系调整年龄、吸烟指数后，AA基因型比AC基因型COPD易患率低18.3%〔OR=0.374，95%CI(0.197，0.708)，P =0.002〕;AA基因型比CC基因型COPD易患率低35.8%〔OR=0.260，95%CI(0.106，0.640)，P =0.002〕;AC基因型比CC基因型COPD易患率低16.7%〔OR=0.201，95%CI(0.849，4.744)，P =0.109〕。

3 讨论

COPD是一种不可逆的气流受限性疾病，本研究结果显示，COPD组FEV1/FVC、FEV1占预计值百分比、25(OH)D水平均低于对照组。有学者指出，由于COPD患者的全身炎性反应、缺乏营养、皮肤老化等问题影响维生素D的吸收、代谢、合成，导致此类患者普遍存在维生素D缺乏［8］。Janssens等［9］在调研COPD患者维生素D缺乏程度时发现，维生素D缺乏与骨质疏松、骨骼肌能力降低引起的骨折密切相关，而这又会引起呼吸运动受限、呼吸肌障碍、FEV1与FVC降低。本研究未对25(OH)D水平与呼吸受限程度进行相关性分析，但从二者在COPD组的低水平表现与已知的研究报道来看，两者相关度紧密。李晓晨等［10］关于COPD的研究结果显示，COPD组与健康组中血清25(OH)D水平与FEV1占预计值百分比均呈正相关。

本研究结果显示，VDBP基因rs2282679多态性与COPD的发生存在相关性，对照组与COPD组VDBP基因rs2282679 A/C等位基因频率与基因型分布比较均有差异;从易患关系来看，CC基因型COPD易患率最高。本研究对rs2282679基因型与25(OH)D水平进行观察，结果CC基因型25(OH)D水平最低，且无论COPD组还是对照组AA、AC、CC基因型者组内25(OH)D水平比较有差异。Ahn等［11］对5个组群的4000余名欧洲人进行全基因与25(OH)D水平的观察发现，25(OH)D水平与SNP位点rs2282679关系密切。一份关于北京、上海地区汉族维生素D水平的报道显示，rs2282679A/C与25(OH)D水平具有相关性，其中C等位基因的单倍体型与25(OH)D水平亦存在关联性［12］。CC基因型的COPD高易患率与其低水平的25(OH)D具有一致性，VDBP表达水平降低，维生素D水平缺乏导致肺功能下降、免疫反应障碍、抗感染能力降低等，继而使COPD发生或加重。

综上所述，VDBP基因rs2282679A/C多态性与25(OH)D水平和COPD易患性密切相关，其中CC基因型者25(OH)D水平最低，患COPD的风险较高。本研究存在地域、入选条件的局限性，如在全国范围的人群中得到证实，将有助于了解我国人群维生素D的调节机制，或可将rs2282679位点CC基因型作为COPD易患性筛选的突变位点。

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Correlation Between rs2282679 A/C Polymorphism in Vitamin D－binding Protein Gene and Chronic Obstructive Pulmonary Disease Pulmonary Disease

WANGMei－qin，ZHANG Jian－zhi，WANG Li.Harrison International Peace Hospital，Hengshui 053000，China

Objective To investigate the correlation between rs2282679 A/C polymorphism in vitamin D－binding protein(VDBP)gene and chronic obstructive pulmonary disease(COPD).Methods Enrolled 120 COPD patients who were admitted into Harrison International Peace Hospital in Hengshui from March 2012 to May 2014 as COPD group.Also enrolled 112 health males who received physical examination in the same period as control group.ELISA was employed to detect serum 25(OH)D，and TaqMan－PCR was used to detect the allele frequency and genotype distribution of rs2282679 A/C in VDBP gene.Results The 25(OH)D levels of control group and COPD group were(55.1±5.8)nmol/L and(37.3±2.3) nmol/L respectively，with control group higher than COPD group(t=31.220，P＜0.001).Control group and COPD group were significantly different in allele frequency and genotype distribution of rs2282679 A/C in VDBP gene(P＜0.05).Control group and COPD group were significantly different in 25(OH)D levels of AA，AC and CC genotypes(P＜0.05).In control group and COPD group，subjects of AA，AC and CC genotypes were significantly different in 25(OH)D level(P＜0.05); subjects of AC and CC genotype were lower than subjects of AA genotype，and subjects of CC genotype were lower than subjects of AC genotype(P＜0.05).After the adjustment of age and smoking indexes，AA genotype is 18.3%lower than AC genotype in susceptibility to COPD〔OR=0.374，95%CI(0.197，0.708)，P=0.002〕;AA genotype is 35.8%lower than CC genotype in susceptibility to COPD〔OR=0.260，95%CI(0.106，0.640)，P=0.002〕;AC genotype is16.7%lower than CC genotype in susceptibility to COPD〔OR=0.201，95%CI(0.849，4.744)，P=0.109〕.Conclusion rs2282679 A/C polymorphism in VDBP gene is significantly associated with COPD.CC genotype is related to the liability of COPD and is closely related with 25(OH)D，and it may be a mutation site for the screening of COPD liability.

Pulmonary disease，chronic obstructive;Vitamin D－binding protein;Genes;Polymorphism，single nucleotide

R 563

A

10.3969/j.issn.1007－9572.2015.30.010

2015－01－21;

2015－07－15)

(本文编辑:陈素芳)

053000河北省衡水市哈励逊国际和平医院(王美芹);河北省衡水市疾病预防控制中心(张建志);河北省衡水市桃城区妇幼保健院(王莉)

张建志，053000河北省衡水市疾病预防控制中心;E－mail:zhangjianzhi99@163.com