NF-κB和AP-1对A型流感病毒性心肌炎组织中异位胰蛋白酶及促炎细胞因子表达的调控*

潘海燕，薛陆静，王逸平，孙花梅，潘闽(南通大学附属医院心内科，重症监护病房，江苏南通600;杭州市西溪医院心内科，浙江杭州00;徐州医学院第二附属医院心内科，江苏徐州006)

NF-κB和AP-1对A型流感病毒性心肌炎组织中异位胰蛋白酶及促炎细胞因子表达的调控*

潘海燕1△，薛陆静2，王逸平3，孙花梅4，潘闽1
(南通大学附属医院1心内科，3重症监护病房，江苏南通226001;2杭州市西溪医院心内科，浙江杭州310023;4徐州医学院第二附属医院心内科，江苏徐州221006)

目的:探讨核因子κB(NF-κB)及激活蛋白1(AP-1)对A型流感病毒(IAV)性心肌炎心肌组织中异位胰蛋白酶及促炎细胞因子表达的调控作用。方法:40只8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为4组:正常对照组经鼻假感染15μL生理盐水;感染对照组经鼻感染40空斑形成单位(PFU)IAV;NF-κB抑制剂组经鼻感染40 PFU的IAV，腹腔注射吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)10mg/kg，每天1次;AP-1抑制剂组经鼻感染40 PFU的IAV，腹腔注射去甲二氢愈创木酸(NDGA)2.5 mg/kg，每天1次。感染后第9天处死小鼠，切取心脏组织分别进行病理及生化检查。结果:IAV感染可诱导心肌组织中异位胰蛋白酶及促炎细胞因子白细胞介素(IL)-6、IL-1β及肿瘤坏死因子(TNF)-α表达显著上调，引发心肌急性炎症反应。PDTC能显著抑制心肌中NF-κB激活以及异位胰蛋白酶和促炎细胞因子表达上调，有效抑制IAV复制，减轻心肌炎症反应(P＜0.01)。NDGA能有效抑制AP-1活性(P＜0.01)，轻度抑制促炎细胞因子表达上调(P＜0.05)，但对异位胰蛋白酶表达、IAV复制及心肌炎症程度无显著影响(P＞0.05)。结论:IAV感染心肌组织后主要通过激活NF-κB诱导心肌中异位胰蛋白酶及促炎细胞因子表达上调，AP-1通路可能仅部分参与了促炎细胞因子的表达调控。

A型流感病毒;病毒性心肌炎;核因子κB;激活蛋白1;胰蛋白酶

［ABSTRACT］AIM:To investigate the regulatory effects of nuclear factor-κB(NF-κB)and activator protein-1 (AP-1)on the expression of ectopic trypsin and proinflammatory cytokines in influenza A virus(IAV)-induced myocarditis.METHODS:Male BALB/c mice of8 weeks old(n=40)were randomly divided into 4 groups:normal control group (NC)，infection control group(IC)，NF-κB inhibitor group(NI)and AP-1 inhibitor group(AI).Themice in NC group and IC group were instilled intranasally with 15μL saline and 40 plaque forming units(PFU)IAV，respectively.Themice in NIgroup and AIgroup were infected intranasally with 40 PFU IAV and injected intraperitoneally with 10 mg/kg NF-κB inhibitor pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)or 2.5 mg/kg AP-1 inhibitor nordihydroguaiaretic acid(NDGA)once daily.Themicewere euthanized at day 9 after instillation，and the heartswere removed for pathological and biochemical analysis.RESULTS:IAV infection induced significant up-regulation of ectopic trypsin，and proinflammatory cytokines interleukin 6 (IL-6)，IL-1βand tumor necrosis factor-α(TNF-α)in themyocardium，and triggered acutemyocarditis.PDTC significantly inhibited NF-κB activation and up-regulation of ectopic trypsin and proinflammatory cytokines，and effectively suppressed IAV replication andmyocardial inflammatory response(P＜0.01).NDGA effectively inhibited AP-1 activity(P＜0.01)and mildly suppressed up-regulation of proinflammatory cytokines(P＜0.05)，but had no effects on the expression of ectopic trypsin，IAV replication and the extent ofmyocarditis(P＞0.05).CONCLUSION:IAV infection induces upregulation of ectopic trypsin and proinflammatory cytokines inmyocardium predominantly by the activation of NF-κB.AP-1 signaling pathwaymight be only partially involved in the regulation of proinflammatory cytokines.

［KEY WORDS］Influenza A virus;Viralmyocarditis;Nuclear factor-κB;Activator protein-1;Trypsin

病毒性心肌炎是临床常见疾病，由于A型流感病毒(influenza A virus，IAV)是人类最常见的感染原，由其引发的心肌炎并不少见，部分心肌炎患者可进展为扩张型心肌病，因此探明其发病机制并进行干预对预防流感病毒性心肌炎具有重要意义。

自然存在的IAV不具有直接入侵细胞的能力，只有当其表面的膜融合糖蛋白血凝素前体(hemagglutinin precursor，HA0)被蛋白酶水解为HA1和HA2后，才能与宿主细胞融合而侵入细胞。胰蛋白酶是一种能够有效水解HA0的蛋白水解酶，除在胰腺组织表达外，还在心、脑、肺等全身多种器官表达［1］。我们前期研究发现，IAV感染能够显著上调心肌组织中的异位胰蛋白酶，被上调的异位胰蛋白酶通过促进流感病毒的感染和复制、诱导细胞因子释放以及激活基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)等机制触发心肌急性炎症反应［1］。核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)是Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)、肿瘤坏死因子受体(tumour necrosis factor receptor，TNFR)、T细胞受体(T-cell receptor，TCR)、B细胞受体(B-cell receptor，BCR)等多种信号通路的关键下游，参与调控多种炎症介质及细胞因子的表达［2-3］。在胰蛋白酶基因的启动区，有NF-κB和AP-1的结合位点。NF-κB和AP-1是否参与了IAV诱导的心肌异位胰蛋白酶及促炎细胞因子表达上调的调控，目前还不清楚。本研究通过分别抑制NF-κB和AP-1激活，探讨NF-κB和AP-1对IAV诱导性心肌炎组织中异位胰蛋白酶及促炎细胞因子表达的调控作用。

材料和方法

1实验动物及病毒

8周龄雄性BALB/c小鼠40只，SPF级，购自扬州大学比较医学中心。PR/8/34(H1N1)A型流感病毒，购自ATCC。

2主要试剂

NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)购自上海百灵威化学技术有限公司;AP-1抑制剂去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid，NDGA)购自Sigma;Trizol试剂(上海生工生物工程股份有限公司);cDNA第一链合成试剂盒及Taq PCRMaster Mix试剂盒(北京天根生化科技有限公司);RIPA裂解液(碧云天生物技术研究所);ECL显影液(CST);兔抗小鼠胰蛋白酶抗体、羊抗小鼠IL-6抗体、兔抗小鼠IL-1β抗体、小鼠抗小鼠TNF-α抗体以及小鼠抗小鼠actin抗体(Santa Cruz);核蛋白提取试剂盒(Pierce);检测NF-κB及AP-1活性的非放射性凝胶电泳迁移率分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)试剂盒(Viagene Biotech)。

3实验方法

3.1心肌炎模型的建立40只雄性BALB/c小鼠经10%水合氯醛(0.3mL/100g)麻醉后，按每组10只随机分为4组:正常对照组经鼻感染15μL无菌生理盐水;感染对照组经鼻腔感染40空斑形成单位(plaque-forming unit，PFU)IAV(溶于15μL生理盐水中);PDTC组经鼻腔感染40 PFU IAV，同时每日1次腹腔注射10mg/kg NF-κB抑制剂PDTC;NDGA组经鼻腔感染40 PFU IAV，同时每日1次腹腔注射2.5 mg/kg AP-1抑制剂NDGA。于感染后第9天麻醉处死小鼠，充分灌洗后取出小鼠心脏，用于病理及生化检测。

3.2RT-PCR使用Trizol试剂提取总RNA，利用cDNA第一链合成试剂盒将2μg RNA逆转录合成cDNA。利用Taq PCR Master Mix试剂盒扩增宿主及IAV目标DNA。胰蛋白酶的上游引物为5’-AGTGGGTGGTGTCTGCAGCTCA-3’，下游引物为5’-GAGTCACCCTGGCAGGAATC-3’;IAV非结构蛋白1 (nonstructural protein 1，NS1)的上游引物为5’-CAGCACTCTTGGTCTGGACAT-3’，下游引物为5’-CCGATGAGGACTCCAACTGCAT-3’;β-actin的上游引物为5’-GGACTCCTATGTGGGTGACGAGG-3’，下游引物5’-GGCCACACGCAGCTCATTGTAGA-3’。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。PCR扩增反应条件为94℃3 min;94℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，35个循环;72℃5 min。RT-PCR产物由琼脂糖凝胶电泳分离及溴化乙啶显影，经凝胶成像系统成像(Bio-Rad)后，利用ImageJ软件测定条带的积分吸光度，以β-actin为内参照，分析目标mRNA的相对表达量。

3.3蛋白免疫印迹实验取100 mg心肌组织至1 mL RIPA裂解液中，利用组织匀浆器提取心肌组织总蛋白并测定蛋白浓度。取等量蛋白经加热变性后上样至10%的SDS-PAGE分离蛋白，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，加入相应I抗，4℃过夜，洗膜后分别加入II抗，室温孵育2 h，再次洗膜。ECL显影液显色，曝光成像，利用ImageJ软件测定积分吸光度，与内参照β-actin的比值作为半定量指标比较目标蛋白的相对表达量。

3.4EMSA实验100 mg心肌组织剪碎经磷酸盐缓冲液清洗后，将组织置于试剂盒提供的胞浆提取液中进行匀浆，根据试剂盒说明书，逐次分离胞浆蛋白和提取核蛋白，测定核蛋白浓度。取5μg核蛋白，根据EMSA试剂盒说明书，分别测定核蛋白中NF-κB及AP-1的活性。NF-κB探针序列为5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’，AP-1探针序列为5’-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3’，DNA探针用生物素标记。凝胶电泳后将DNA探针转移至尼龙膜，紫外线交联将DNA固定于尼龙膜上，通过化学发光法显影，曝光成像。利用ImageJ软件测定积分光密度，所得结果表示转录因子与标记探针的结合活性。以正常对照组转录因子结合活性为参照，比较各组相对活性变化。

3.5HE染色5μm石蜡切片经脱蜡、水化后，放入苏木精水溶液中染色，经流水冲洗后再乙醇脱水，然后放入伊红染色液中染色，再经乙醇脱水后放入二甲苯溶液中使组织透明，树胶封片，显微镜下观察。

3.6心肌组织病理评分心肌组织中有局灶性炎症浸润，伴或不伴相关心肌细胞坏死，则判定为心肌炎。根据心肌组织中炎症细胞的浸润情况，采用A-bel等［4］提出的0～4分分级法，对心肌炎进行病理评分和半定量分析:0分为无炎症浸润;1分为心肌细胞间有小灶性炎症浸润，或炎症细胞包绕单个心肌细胞;2分为炎症浸润灶较大，炎症局灶有100个以上炎症细胞，或炎症灶包绕30个以上心肌细胞;3分为10%以上心肌组织切面被炎症浸润;4分为30%以上心肌组织切面受累。

4统计学处理

采用SigmaStat 3.5统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示。多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1各组小鼠心脏炎性渗出及心肌组织炎症比较

在感染后第9天，正常对照组心脏表面光滑，无炎性渗出，心肌细胞排列整齐，无炎症细胞浸润;感染对照组可见心脏表面有大量炎性渗出，心肌间质内有大量炎症细胞浸润，伴局部组织小灶性坏死; PDTC组心脏表面炎性渗出显著减轻，心肌间质内炎症细胞也显著减少;NDGA组心脏表面炎性渗出及心肌内炎症细胞浸润较感染对照组有所改善，但不如PDTC组明显。对小鼠心肌组织炎症程度进行病理评分，结果显示，与感染对照组比较，NF-κB抑制剂PDTC能显著降低感染后第9天小鼠心肌组织病理积分(P＜0.01)，AP-1抑制剂NDGA对小鼠心肌组织病理评分有所改善，但差异无统计学意义(P＞0.05)，见图1。

Figure 1.Comparison ofmousemyocardial inflammatory infiltration among different groups.Mean±SD.n=5.＊＊P＜0.01 vs normal control;△△P＜0.01 vs infection control;▲P＜0.05 vs PDTC.图1　各组小鼠心肌炎症浸润情况的比较

2各组小鼠心肌组织中NS-1及异位胰蛋白酶表达比较

PCR检查结果显示，感染后第9天心肌组织中病毒NS1基因大量复制，胰蛋白酶mRNA表达显著上调，免疫印迹结果显示胰蛋白酶原及胰蛋白酶表达显著上调。PDTC能显著抑制胰蛋白酶mRNA及蛋白表达，显著降低NS1 mRNA水平，有效抑制IAV复制(P＜0.01)。NDGA对心肌中异位胰蛋白酶表达及IAV复制无显著影响(P＞0.05)，见图2。

Figure 2.The expression of viral NS1 and ectopic trypsin in the mouse myocardium among different groups.Mean± SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs normal control;△△P＜0.01 vs infection control;▲▲P＜0.01 vs PDTC.图2　各组小鼠心肌组织中NS1及异位胰蛋白酶表达的比较

3各组小鼠心肌组织中促炎细胞因子表达比较

对小鼠心肌中促炎细胞因子IL-6、IL-1β及TNF-α进行免疫印迹检测显示，感染后第9天心肌组织中IL-6、IL-1β及TNF-α表达显著上调。PDTC及NDGA治疗均能显著抑制IL-6、IL-1β及TNF-α表达上调(P＜0.05或P＜0.01)。但PTDC抑制促炎细胞因子上调的效果显著强于NDGA(P＜0.05)，见图3。

Figure 3.The expression of proinflammatory cytokines in the mousemyocardium among different groups.Mean± SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs normal control;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs infection control;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs PDTC.图3　各组小鼠心肌组织中促炎细胞因子表达的比较

4各组小鼠心肌组织中NF-κB及AP-1活性比较

EMSA法探针特异性检测结果显示，在无核蛋白组未检测到转录因子活性。当核蛋白中加入过量未标记探针后，转录因子结合活性被明显削弱而不能被标记探针测及，提示探针具有特异性。对各组小鼠心肌核蛋白中NF-κB及AP-1的DNA结合活性检测显示，正常对照组NF-κB活性较弱，IAV感染后NF-κB活性被显著上调(P＜0.01)，约为正常对照组7倍。AP-1活性也有所上调(P＜0.01)，约为正常对照组2倍。PDTC能有效抑制NF-κB活性(P＜0.01)，对AP-1活性无明显影响。NDGA能有效抑制轻度上调的AP-1活性(P＜0.01)，对NF-κB活性无显著影响，见图4。

Figure 4.DNA binding activity of NF-κB and AP-1 in themouse myocardial nucleus among different groups.Mean± SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs normal control;△△P＜0.01 vs infection control;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs PDTC.图4　各组小鼠心肌细胞核中NF-κB及AP-1的DNA结合活性

讨论

心肌中异位胰蛋白酶能够促进IAV感染，触发急性病毒性心肌炎，抑制胰蛋白酶活性或表达，能够有效抑制病毒复制，降低促炎细胞因子表达，减轻心肌炎症反应［1，5］。因此，探明心肌中异位胰蛋白酶及细胞因子的表达调控，对靶向干预胰蛋白酶及细胞因子表达，有效预防IAV感染和减轻心肌炎症反应具有重要意义。

NF-κB是一种重要的核转录因子，常以p50-p65异二聚体的形式与其抑制蛋白IκB结合，以无活性状态存在于细胞胞浆中［6］。当细胞受刺激后，NF-κB与其抑制蛋白解离而激活，转入细胞核内，诱导促炎细胞因子、炎症介质等多种蛋白基因转录，参与感染、炎症、免疫反应及细胞凋亡和分化等病理生理过程。PDTC通过阻断IκB的从头磷酸化来抑制IκB降解失活，从而抑制NF-κB的激活，阻止NF-κB活化入核。PDTC作为一种抗氧剂，还可通过清除IAV感染诱导的活性氧(reactive oxygen species，ROS)、调节氧化/抗氧化平衡来抑制NF-κB激活［7］。此外，PDTC还可通过抑制IAV双链RNA合成以及编译HA基因的信使RNA合成而发挥抑制IAV复制的作用［7-8］。PDTC能特异性阻断NF-κB激活，对其它转录因子如AP-1、特异性蛋白1(specificity protein 1，Sp-1)等的激活均无影响［9］。

AP-1是细胞内由c-Jun蛋白和c-Fos蛋白家族成员组成的一种重要转录因子，可被促分裂素原活化蛋白激酶、蛋白激酶C和蛋白酪氨酸激酶等信号通路活化，调控多种细胞因子以及炎症介质的表达，被誉为细胞内信号转导的第3信使。NDGA是一种天然抗氧化剂，广泛存在于多种含树脂的植物中。它通过直接干扰fos-jun二聚体与DNA序列结合而抑制fos-jun-DNA复合结构形成，从而阻断AP-1的基因调控作用。作为抗氧化剂，NDGA是有效的ROS清除剂，还可在基因转录过程中，通过限制病毒Sp-1与DNA作用来干扰Sp-1蛋白的反式激活功能而发挥抗病毒作用［10］，NDGA对NF-κB的激活无直接影响［11］。

本研究通过使用PDTC及NDGA分别抑制NF-κB和AP-1的活性，来探明NF-κB和AP-1对心肌中异位胰蛋白酶及促炎细胞因子表达的调控作用。由于我们既往研究发现心肌中的异位胰蛋白酶及促炎细胞因子水平在IAV感染后第9天达到高峰，遂于感染后第9天处死小鼠。研究发现，IAV感染后小鼠心肌组织中NF-κB活性显著上调，PDTC能够显著抑制NF-κB激活和心肌中异位胰蛋白酶及促炎细胞因子表达上调，抑制IAV在心肌组织中复制，有效减轻心肌炎症浸润程度。AP-1活性在IAV感染后第9天也有所上调，但上调幅度不及NF-κB明显。NDGA能有效抑制IAV诱导的AP-1活性上调，部分抑制促炎细胞因子的表达，其对细胞因子表达的抑制效果不及PDTC显著，对心肌中异位胰蛋白酶表达及病毒复制无显著影响。这些结果提示，IAV感染主要通过激活NF-κB信号通路诱导心肌组织中异位胰蛋白酶及促炎细胞因子表达显著上调。AP-1信号通路仅部分参与了心肌中促炎细胞因子的表达调控，但不参与对心肌中异位胰蛋白酶表达的调控。

在病毒性心肌炎的急性阶段，病毒入侵本身、病毒感染直接破坏心肌组织所释放的损伤物质以及促炎细胞因子等均可诱使炎症细胞向感染部位聚集，参与急性心肌炎症反应［12］。本研究发现，NDGA虽能有效抑制AP-1活性，轻度抑制促炎细胞因子表达上调，但对心肌炎症的改善程度并无统计学意义。我们推测可能与AP-1仅部分参与了IAV感染所诱导的细胞因子表达上调，对胰蛋白酶表达及IAV复制无显著影响，其抑制剂NDGA轻度抑制促炎细胞因子表达上调所产生的益处尚不足以抵消病毒急性感染所引发的急性心肌损伤有关。

NF-κB及AP-1作为细胞核内重要的转录因子，是TLR、TNFR、TCR及BCR等多种细胞信号转导途径在细胞核内的汇聚点［2-3］。IAV感染后可激活TLRs(TLR3、TLR7和TLR8)以及维甲酸诱导基因Ⅰ等多种信号通路［13］，引发机体产生一系列病理生理反应。IAV感染后究竟经由哪些通路下传引发NF-κB及AP-1的激活还不清楚，我们正在深入研究。

目前对病毒性心肌炎的治疗除抗病毒及对症支持处理外，还没有特别有效的治疗措施。本研究发现提示，特异性阻断NF-κB可能成为预防和治疗流感病毒性心肌炎的新策略。

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Regulation of ectopic trypsin and proinflammatory cytokine expression by NF-κB and AP-1 in influenza A virus induced m yocarditis

PAN Hai-yan1，XUE Lu-jing2，WANG Yi-ping3，SUN Hua-mei4，PAN Min1
(1Department of Cardiology，3Intensive Care Unit，Affiliated Hospital of Nantong University，Nantong 226001，China;2Department of Cardiology，Xixi Hospital of Hangzhou，Hangzhou 310023，China;4Department of Cardiology，The Second Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou 221006，China.E-mail:dr.panhy@gmail.com)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.004

1000-4718(2015)05-0791-06

2014-10-16［修回日期］2015-03-19

国家自然科学基金青年基金资助项目(No.81100154)

Tel:0513-81161301;E-mail:dr.panhy@gmail.com