长治地区19113例新生儿耳聋基因检测

李晓泽　马卫平　胡志鹏　药泽蓉　魏魏山西省长治市妇幼保健院医学遗传室（长治046011）

·临床研究·

长治地区19113例新生儿耳聋基因检测

李晓泽马卫平胡志鹏药泽蓉魏魏
山西省长治市妇幼保健院医学遗传室（长治046011）

目的用耳聋基因芯片方法检测19113名新生儿是否存在中国人常见耳聋基因的异常。方法采集2013年6月-12月长治市辖区内出生的19113名新生儿足跟血并提取DNA，应用耳聋基因芯片检测4个常见耳聋基因的9个突变位点，包括GJB2（35 del G，176_191del 16，235 del C，299_300 del AT）、GJB3 （538 C＞T）、SLC26A4（IVS 7-2 A＞G，2168 A＞G）和线粒体DNA 12S rRNA（1555 A＞G，1494 C＞T）。同时对19113名新生儿的基本信息进行了调查，包括听力学检查。结果 19113名新生儿中，共检测出耳聋基因异常者984例（5.15%），其中GJB2基因杂合突变437例（2.29%），235de1C纯合突变2例（0.01%），线粒体DNA 12S rRNA突变66例（0.35%），SLC26A4基因杂合突变型395例（2.07%），GJB3基因杂合突变62例（0.32%），双杂合突变型22例（0.12%）。结论长治地区新生儿常见耳聋基因突变以GJB2基因突变、SLC26A4基因突变为主。基因突变率以城区、长治县和襄垣县居多，新生儿耳聋基因筛查可以对药物性耳聋、PDS综合征等听力筛查无法检测的迟发性耳聋进行检测。

新生儿；耳聋基因；突变；基因芯片

耳聋是常见的残疾之一。科学家研究显示，超过60%的耳聋是由遗传因素造成的［1］。据统计，每1000个新生儿中就有1～3例聋儿。2013年召开的世界卫生组织全球防聋合作中心会议暨中国听力论坛上报告显示，我国现有听力残疾者2780万人，其中，0～6岁听障儿童约13.7万，且每年以2.3万的数量递增［1-2］，而其中至少一半的聋儿是由于遗传缺陷引起的，可见遗传因素在致聋中所起的重要作用［3］。因此，正确作出病因分析，提出早期干预措施，是降低耳聋发生的有效途径。本研究应用耳聋基因芯片技术对19113例新生儿进行常见遗传性耳聋基因的诊断，结合传统的新生儿听力筛查，更加全面的对新生儿进行听力学的筛查，避免耳聋发生。

1　对象与方法

1.1研究对象

2013年6月-12月长治市辖区内出生的19113名新生儿，收集研究对象基本信息患者的听力学检查。采集19113名新生儿足跟血2滴并密封保存，提取DNA，进行耳聋基因检测。

1.2仪器德国chemagen全自动DNA提取仪晶芯®SlideWasher8芯片洗干仪、长风XMTD6000水浴箱、晶芯®LuxScan10K-B微阵列芯片扫描仪-523nm、BIOER Life Express PCR仪、微量核酸浓度测定仪。

1.3试剂

对984例耳聋基因突变者按地区进行分析，可见城区、长治县和襄垣县突变率居各县市区首位，分别为8.26%、5.51%和4.99%。见表3。

1.4实验方法

1.4.1血片DNA的提取

用德国PE公司的CMG-777全自动DNA提取仪提取干血片DNA 50μl。

1.5质量控制

1.4.2PCR扩增

术后随访6个月～4年，其中1例双侧声带乳头状瘤患者分别于术后3个月、10个月复发，再次给于CO2切除，其中一例未复发，1例复发并癌变，行额侧喉部分切除。其余17例治愈。其中2例发生声带前部粘连。所有患者术后均未出现呼吸困难、出血等并发症发生。

1.4.2.1PCR反应体系：

25μl的PCR反应体系包括：PCR扩增试剂引物混合物A 20 μl，模板DNA5.0 μl；PCR扩增试剂引物混合物B 20 μl，模板DNA 5.0 μl。

1.4.2.2PCR扩增程序

（以0.5℃/s的速度从94℃降温至55℃；以0. 2℃/s的速度从55℃升温至70℃）扩增程序见表1。

影响蜂蜜黏度的关键因素是温度和蜂蜜的含水量，在5 ℃～25 ℃范围内，蜂蜜的黏度随温度升高而降低，随含水量升高而降低且含水量越低的蜂蜜黏度对温度的变化越敏感。

1.4.3芯片杂交

按每份样品4 μ1磁珠和20 μ1结合液进行配制，混匀后分装到8联排管中。将扩增好的产物A、B分别取10 μ1加入到配制好的磁珠中，混匀后静置10min，磁力板吸附弃废液，每份样品中加入0.1mol/L NaOH 60μ1，混匀，静置10min，磁力板吸附弃废液，再加入提前50℃预热的杂交缓冲液40μ1，磁力板吸附弃废液，加入20μ1杂交缓冲液。将杂交反应混合物经盖片上的加样孔垂直加入14 μ1杂交混合物，迅速盖上杂交盒盖并密封。将密封好的杂交盒水平放入50℃预热的水浴箱中杂交60 min。

1.4.4芯片洗涤

杂交反应结束后，将杂交盒水平取出拆开，将芯片取出，放入芯片洗涤机中按程序进行洗涤，洗涤完成后放入芯片甩干机中离心3-5min。

1.4.5芯片扫描

DNA提取、PCR扩增、杂交过程的所有试剂及器皿均进行严格的消毒。对无法判断结果的样品进行重复实验，并随机抽取5%样品进行重复实验。样品DNA浓度纯度测定按照5%进行抽检，浓度纯度均达到实验要求。

1.4.6结果判读

QC：表面化学质控探针　PC：杂交阳性对照探针IC：基因扩增内对照探针　BC：空白对照探针NC：阴性对照探针　MC：磁珠质控探针

若在同个位点中W行检测数据为阳性，同时M行为阴性，判读结果为该位点野生型；若在同个位点中W行检测数据为阳性，同时M行为阳性，判读结果为该位点突变杂合型；若在同个位点中W行检测数据为阴性，同时M行为阳性，判读结果为该位点突变纯合型。

根据全省闪电监测数据分析显示,7月27日19:00—20:00,在事发地5 km范围内,共监测到4次负地闪,强度分别为25.7～43.6 kA,地闪位置距离事发地分别为0.97～3.46 km。廊桥附近的监控视频显示,27日19:35事发前后,廊桥所在地出现大风、雷电、降雨等天气。

为了进一步刻画研究区县域经济的时间演变特征，采用ArcGIS的自然间断点分级法，将综合经济得分排名变化划分为三类，分别表示综合实力稳定区、综合实力上升区和综合实力下降区三种类型，绘制了2000—2015年成都平原城市群县域经济发展水平变化图(见图1).

使用晶芯®LuxScanTM10K-B微阵列芯片扫描仪进行芯片扫描，使用晶芯®遗传性耳聋基因检测芯片判别系统进行信号的读取及判断。

表1　PCR扩增程序

表2　19113例耳聋患者耳聋基因检测结果

2　结果

2.119113例新生儿耳聋基因检测结果

440C高碳高铬马氏体不锈钢锻件是公司承接的某公司用轴承应力环锻件。两批次锻件的理化试样在长时间退火后进行淬火，在淬火冷却过程中和冷处理过程中均出现了开裂现象。为找出断裂失效原因，对淬裂样件进行了分析检测。

19113名新生儿中，共检测出耳聋基因异常者984例（5.15%），其中GJB2基因杂合突变437例（2.30%），235de1C纯合突变2例（0.01%），线粒体DNA 12S rRNA突变66例（0.34%），SLC26A4基因杂合突变型395例（2.07%），GJB3基因杂合突变62例（0.32%），双杂合突变型22例（0.11%）。见表2。

2.3耳聋基因和听力筛查结果

米九每次卸货的时候和措姆、登子一起进营业部大院。有几次休息时，甲洛洛看到米九正用手指头沾尘土中掉落的几粒白糖吃，有些时候给他一个装豆瓣的竹条笼子，他高兴得像个孩子，一路舔着竹条上的豆瓣走回家。可甲洛洛不敢肯定他看到的这些是否是真的，因为这么多年的经验告诉他：表象是最不可靠的。

德国全自动提取样本DNA，耳聋基因检测用博奥生物有限公司生产的晶芯®遗传性耳聋基因检测芯片试剂盒（24人份）。

2.2地域性结果

19113例新生儿均进行了听力筛查，其中未通过的有39人，均无耳聋家族史，其中耳聋基因异常未通过者有4人，突变类型为235de1C纯合突变2人、235de1C杂合突变2人。

学生的思想品德形成过程中，情感起着“穿针引线”的作用。可以说，学生的情感因素对整个教学活动有很大的引导、激励、强化作用。因此，在品德课教学活动设计时，教师要更多地设计能激发学生情感的活动，有助于挖掘学生的内心体验，唤起、强化、升华学生的道德情感，使情理交融，从而促进品德内化。

3　讨论

耳聋是影响人类健康的一种常见疾病，也是临床上常见的遗传性疾病。研究表明，遗传性耳聋约占耳聋患者的60%，其中75%-80%为常染色体隐性遗传，10%-20%为常染色体显性遗传，其余为X连锁和线粒体遗传等［4］。流行病学调查显示，我国遗传性耳聋人群以GJB2、GJB3、PDS和线粒体12S rRNA基因突变为主［5-7］。此外，我国幅员辽阔，各地区在耳聋基因突变热点的分布频率上有一定差异。本研究进行的新生儿耳聋基因筛查是长治市政府组织的惠民工程项目，通过对本地区新生儿进行听力筛查和耳聋基因筛查，了解当地正常人群中遗传性耳聋所占比例及常见耳聋基因突变位点的分布，筛选检出率较高的致聋突变位点和未见常见耳聋基因突变位点的病例，为减少耳聋患者提供依据。

当今社会医患矛盾异常尖锐，患者对医生的信任与满意度下降，这与医生的素质密切相关。医生应自觉成为医学本身规律和目的的捍卫者，积极把握医学发展方向和速度，努力参与到医疗体制改革中来，自觉抵制过度追逐名利、过度依赖仪器设备的行为，自觉追求医学行业自诞生起便倡导的职业道德[5]。为了减少医患纠纷，医学教育需要从提升医学生职业素养入手，为社会输送具有崇高职业理想、职业信念、职业道德的高素质医学人才，将医学生思想政治教育与职业素养培育相结合。

本研究采用博奥生物有限公司生产的晶芯®九项遗传性耳聋基因检测试剂盒对19113名新生儿的4个耳聋相关基因9个突变位点进行了检测。研究发现，长治地区正常人群中耳聋基因突变位点以IVS 7-2 A＞G（1.86）和235 del C（1.73%）最多，显示SLC26A4基因IVS 7-2 A＞G杂合突变和GJB2基因235de1C杂合突变为本地区耳聋基因热点突变点，与多个研究中的结果相一致［8］。

胜利油田直井长缝压裂应用效果研究………………………………………………………………………………张军峰（4.17）

长治地区13个县市区耳聋基因突变类型地域性分布结果显示城区、长治 县和襄垣县突变率居各县市区首位，分别为8.26%、5.51%和4.99%。这些地区呈现高突变率趋势的原因，有待于进一步研究（环境污染是否导致遗传性耳聋突变尚无定论，如有相关报道或考虑相关性的依据，可提出）。

研究中我们发现单纯进行听力筛查可为耳聋发病原因提供部分依据，但像药物性耳聋突变（即线粒体DNA 12S rRNA突变）和PDS类型（即SLC26A4基因杂合突变型）一般的听力筛查并不能检测出这些迟发性耳聋类型；由于晶芯®九项遗传性耳聋基因检测试剂盒只检测中国人常见的4个耳聋相关基因9个突变位点，会出现耳聋基因筛查结果通过其听力筛查结果未通过的情况。所以进行听力和耳聋基因的联合筛查可极大地提高新生儿耳聋疾病的检出率。（未凸显本研究的意义）。

对于检测出GJB2基因突变而无其它神经及听觉中枢障碍者，可通过尽早人工耳蜗植入，提高听力语言康复效果［9］。对于可引起大前庭水管综合征的SLC26A4基因IVS纯合突变人群，虽然出生时可能听力正常，但是在日常生活中需要避免头部受到碰撞、重击，以减慢或避免耳聋的发生。对于线粒体DNA 12S rRNA突变引起的药物性耳聋易感者，提供生活指导卡片避免接触相关药物，减少药物性耳聋发生。本研究提供的基础数据将为分析病因，早期干预，降低本地区耳聋发生提供帮助。

表3　长治市各地区耳聋基因突变类型分布结果

1韩东一.中国聋病防治现状.中华耳科学杂志，2007，4（5）：345-349.

1刘学忠，欧阳小梅，Yan D，等.中国人群遗传性耳聋研究进展.中华耳科学杂志，2006，4（2）：81-89.

2陈焕玲.153例耳聋患者的耳聋基因芯片检测.吉林：吉林大学.2008.

3王继，张铁松.遗传性耳聋的基因研究进展.医学综述，2013，2（3）：442-444.

4张强伟.129例非综合征型耳聋患者耳聋基因的筛查.山西：山西医科大学.2012.

5戴朴，刘新，于飞，等.18个省市聋校学生非综合征性聋病分子流行病学研究GJB2 235de1C和线粒体DNA 12SrRNAA1555G突变筛查报告.中华耳科学杂志，2006，1（4）：1-5.

6于飞，戴朴，韩东一.GJB2基因突变及语前遗传性非综合征性耳聋.国外医学耳鼻咽喉科学分册，2005，29（6）：359-361.

7戴朴，朱秀辉，袁永一，等.Pendred综合征基因热点突变筛查赤峰市聋哑学校大前庭水管综合征患者.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2006，41（7）：497-500.

8周怡，刘海红，郝津生，等.15343例新生儿耳聋基因普遍筛查结果分析.中国听力语言康复科学杂志，2014，2：109-112.

9戴朴.遗传性耳聋的预防与阻断.中华医学杂志，2007，87（40）：2811-2813.

ChangZhi District 19113 Cases Of Neonatal Deafness Gene Detection

LI Xiaoze，MA Weiping，HU Zhipeng，YAO Zerong，WEI Wei
Changzhi city，Shanxi Province maternal and child health care medical genetic chamber，Changzhi，046000，China Corresponding author：WEI WeiEmail：WeiWei2006_1@126.com

Objective 19113 newborns with deafness gene chip testing whether there is a Chinese common deafness gene abnormality.Methods Gathering on June 6,2013-December 19113 infants born within their respective jurisdictions of changzhi city heel blood and extract DNA,application of deafness gene chip to detect nine four common deafness gene mutations,including GJB2(35 del G,176_191del del 16235 C, 299_300 del AT),GJB3(538 C>T),SLC26A4(IVS,7-2 A>G 2168 A>G)and mitochondrial DNA 12 s rRNA(1555 A>G,1494 C>T).The basic information of 19113 newborns were investigated,including audiology examination.Results 19113 infants were detected deafness gene was abnormal in 984(5.15%),hybrid GJB2 gene mutations among 437 cases(2.29%),235 de1c homozygous mutations in 2 cases(0.01%),12 s rRNA mitochondrial DNA mutation in 66 cases(0.35%),hybrid SLC26A4 gene mutation type 395 cases (2.07%),hybrid GJB3 gene mutation in 62 cases(0.32%),double heterozygous mutations in 22 cases(0.12%). Conclusions Changzhi region newborn common deafness gene mutation is given priority to with GJB2 gene mutations,SLC26A4 gene mutations.Gene mutation rate in the majority with city,changzhi county and xiangyuan county,neonatal deafness gene screening of drug-induced deafness,PDS syndrome detecting a late-onset deafness hearing screening cannot be detected.

The newborn；Deafness genes；Mutation；Gene chip

R764.43

A

1672-2922（2015）03-658-4

2015-10-9审核人：郭维维）

10.3969/j.issn.1672-2922.2015.04.020

李晓泽，医学学士，主管技师，研究方向：医学遗传学

魏魏，Email：WeiWei2006_1@126.com